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目的1.探讨全反式维生素A(RA)对Nitrofen诱导的先天性膈疝大鼠胎肺体外培养模型的影响,研究RA对CDH肺发育不良的作用。2.探讨STRA6在正常妊娠大鼠胎肺发育过程中的表达特点和作用。3.探讨STRA6在Nitrofen诱导的先天性膈疝大鼠模型胎肺发育过程中表达特点和作用。方法1.动物模型的建立和实验分组成年SPF级SD雌性大鼠24只,编号后根据随机数字法分为对照组和Nitrofen诱导组,将雌性与雄性SD大鼠合笼过夜,翌日阴道涂片镜下检及精子视为妊娠,当天上午定为妊娠第0.5天,雌鼠受孕后第13.5、15.5天对照组和Nitrofen诱导组各分配2只孕鼠,第17.5, 21.5天对照组和Nitrofen诱导组各分配4只孕鼠;Nitrofen诱导组大鼠于妊娠第9.5天、在乙醚吸入浅麻醉下经胃管注入Nitrofen 100mg(溶于橄榄油,浓度100mg/ml),对照组大鼠仅注入1ml橄榄油。两组分别于妊娠第13.5天、15.5天、17.5天、21.5天在麻醉下行剖宫产取出胎鼠,解剖后取左肺胎肺进行下一步实验。第13.5天胎肺用于器官培养实验,按孕鼠是否灌入Nitrofen和是否在培养基中添加外源性RA分为四组:对照组(n=6),对照+RA组(n=6),Nitrofen组(n=6),Nitrofen+RA组(n=6);第15.5天全部胎肺,第17.5天和第21.5天部分胎肺用于荧光定量PCR实验,按孕鼠是否灌入Nitrofen分为两组:Nitrofen诱导组(n=18)和对照组(n=18);第17.5天和第21.5天部分胎肺用于免疫荧光组织化学实验,分为两组:Nitrofen诱导组(n=12)和对照组(n=12)。2.器官培养的方法研究RA对Nitrofen诱导的先天性膈疝大鼠胎肺体外培养模型的影响第13.5天时剖宫产取出胎鼠后,HBSS清洗三次,在NIKON SMZ—1000体视显微镜下取出胎鼠左肺胚芽后放置在12孔TRANSWELL板上,在下层加入DMEM-F12无血清培养基或含RA的培养基。放入37度含5% CO2培养箱中培养96小时,每24小时更换培养液,在显微镜下观察生长情况并记录图像。对照+RA组,Nitrofen+RA组在培养基中添加含1umol/l RA的无水乙醇于DMEM-F12无血清培养基中,终浓度为0.4%。用Image-pro plus version 6.0图像分析软件对肺发育参数肺面积和周长进行统计分析。3.实时荧光定量PCR(QPCR)方法检测STRA6 mRNA在Nitrofen诱导的先天性膈疝大鼠胎肺中的表达Trizol法提取胎肺标本总RNA,核酸定量仪检测各标本总RNA浓度,并用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性。采用两步法实时荧光定量PCR(Taqman探针法)技术检测各标本中STRA6和管家基因β-actin mRNA的浓度(每个样品设两个复管,由相对标准曲线计算得出浓度),然后分别经过管家基因校正和参照组样本校正得出各胎肺标本中STRA6 mRNA的相对表达量。4.免疫荧光组织化学(immunofluorescence,IMF)方法检测STRA6蛋白在itrofen诱导的先天性膈疝大鼠胎肺的表达采用免疫荧光组织化学方法检测STRA6蛋白在对照组和Nitrofen诱导组第17.5天、第21.5天的表达情况,计算免疫荧光数量。结果1. Nitrofen诱导的CDH大鼠模型的构建对照组的12只孕鼠经剖宫产得到胎鼠85只;Nitrofen诱导组第13.5天和第15.5天4只孕鼠共得到胎鼠30只,第17.5天和第21.5天8只孕鼠共得到胎鼠61只,其中膈疝共28只,占45.9%(28/61)。膈疝均为左侧的后外侧巨大膈疝,疝入的腹腔脏器主要为肝脏和胃,小肠和脾脏也有疝入。解剖膈疝胎鼠胸腔后可见双肺均缩小,与对照组相比左侧肺变小更明显。2.组织学检查对照组大鼠肺发育较为成熟,而在Nitrofen诱导组的胎鼠肺发育明显滞后,支气管分支减少,大部分肺泡塌陷,肺泡间隔弥漫性的增宽,肺泡管、肺泡及肺泡囊呈假腺体样改变。小动脉肌层增厚,平滑肌细胞增生。部分小动脉可见平滑肌异常分布。3.RA对Nitrofen诱导的先天性膈疝大鼠胎肺体外培养模型的影响形态学结果:对照组和对照+RA组肺胚芽发育明显比Nitrofen组和Nitrofen+RA组成熟,培养96小时后,可见胚芽发育并增殖;Nitrofen组肺胚芽发育差,培养72小时后肺胚芽逐渐出现发育停止和坏死的情况;Nitrofen+RA组肺胚芽发育明显改善。发育参数结果:培养96小时后,对照组与对照+RA组相比,肺面积(2.535±0.423 mm2 vs 2.088±0.622 mm2)及周长(6.544±0.710 mm vs 6.593±1.133 mm)无统计学意义; Nitrofen+RA组的肺面积比Nitrofen组(1.867±0.032 mm2 vs 1.053±0.033 mm2)明显增多,有统计学意义(P<0.05),周长(6.237±0.581 mm vs 4.862±0.458mm)无统计学意义(P=0.53);对照组和对照+RA组分别与Nitrofen组相比,肺面积及周长均有统计学意义(p<0.05);4.QPCR检测STRA6 mRNA在Nitrofen诱导的先天性膈疝大鼠胎肺中的表达对照组:STRA6 mRNA相对表达量呈下降趋势,各时期的相对表达量分别为14.800±5.155,4.061±2.765,1.000±0.449,第15.5天与第17.5天和第21.5天相比有统计学意义(P=0.000<0.01);Nitrofen组:STRA6 mRNA相对表达量波动,各时期的相对表达量分别为1.191±0.351,7.552±3.716,0.951±0.942,D17.5天表达升高,第17.5天与第15.5天和第21.5天相比有统计学意义(P=0.000<0.01);在第15.5天,对照组与Nitrofen诱导组相比有统计学意义(P=0.000<0.01)5.免疫荧光组织化学检测STRA6蛋白在Nitrofen诱导的先天性膈疝大鼠胎肺中的表达第17.5天对照组与Nitrofen诱导组免疫荧光数量分别为809.500±82.243、1471.167±228.687,两组相比有统计学意义(P=0.000<0.01),结论1.在第13.5天,肺发育早期,对照组与对照+RA组肺胚芽发育明显比Nitrofen组和Nitrofen+RA组成熟,这表明Nitrofen在胚胎发育早期就导致肺发育不良。2.外源性添加RA培养96小时后,RA能明显改善Nitrofen诱导的先天性膈疝大鼠胎肺体外培养模型的肺胚芽面积.这表明RA能明显改善Nitrofen诱导的CDH肺发育不良。3.在第15.5天,肺发育早期,Nitrofen诱导组STRA6 mRNA相对表达量水平比对照组显著降低,结合STRA6的生物学功能:转运Vit A和调节细胞吸收Vit A,我们推测Nitrofen能诱导CDH肺发育不良的发生的原因,可能是干扰肺细胞表面RBP受体STRA6的表达,导致肺细胞吸收Vit A障碍所致。4.在第17.5天,肺发育中期, Nitrofen诱导组STRA6蛋白荧光数目比对照组显著升高,STRA6 mRNA相对表达量水平升高(p=0.095),这可能是维A酸信号途径对肺细胞内的VitA水平低下的一种负反馈反应。