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研究背景:乳腺癌是目前女性中发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。随着乳腺癌研究的深入和治疗手段的发展,该病的预后正不断改善。多数乳腺癌患者在治疗后可获得明显缓解,即使Ⅲ期乳腺癌患者五年生存率亦可达到70%左右。但即便如此,患者的长期生存依然很难做到,而导致乳腺癌患者死亡的首要因素就是肿瘤的转移。因此控制肿瘤转移是乳腺癌治疗相关的研究中亟待解决的问题。化疗是乳腺癌治疗的常规手段之一,在临床上有着广泛的应用。化疗药物通过其细胞毒性作用杀伤肿瘤细胞,通常用作乳腺癌患者手术前后的辅助治疗,或者作为保守治疗方法应用于不能接受手术的患者。但既往有研究表明,化疗具有潜在的促进肿瘤转移的效应。我们认为损伤性的环境因素可以引起肿瘤的应激反应,促使肿瘤转移以逃避不利环境。化疗作为一种强烈的损伤因素,对于肿瘤来说显然是一种强烈的应激信号,是否具有刺激肿瘤转移的效应,值得探讨。转移相关蛋白1(Metastasis-associated protein 1,MTA1)是一个与乳腺癌转移密切相关的重要分子,其过表达常见于包括乳腺癌在内的多种人类恶性肿瘤,且往往预示着肿瘤的高级别、高转移倾向和不良预后。更重要的是,MTA1是一种应激反应蛋白,其表达明显受到环境因素的调控。损伤性条件如缺氧、紫外线、电离辐射和炎症等均可诱导MTA1的表达,而化疗对乳腺癌细胞中MTA1表达水平的影响,尚未见文献报道。因此我们希望通过实验,观察化疗对乳腺癌转移潜能的影响,分析在此过程中MTA1表达水平的变化及其发挥的作用,将MTA1与化疗后乳腺癌细胞生物学行为的改变联系起来。目的通过观察化疗药物表柔比星处理前后乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力,分析化疗对乳腺癌转移潜能的影响。通过比较表柔比星处理前后乳腺癌细胞中MTA1的表达水平,以及在抑制MTA1表达后观察表柔比星处理效应的变化,分析MTA1在化疗造成的乳腺癌细胞的生物学行为改变中发挥的作用。通过对乳腺癌小鼠模型给予表柔比星处理,观察体内化疗对乳腺癌肺转移的影响。方法1.对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231给予半数抑制剂量的表柔比星处理6h或12h,用划痕实验和transwell实验分析化疗对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。2.提取表柔比星处理组和未处理组细胞的总RNA和蛋白,通过Real-time PCR和Western blot分析表柔比星处理对乳腺癌细胞中MTA1表达水平的影响。3.用无意义的NC si RNA或MTA1特异性si RNA转染MCF-7和MDA-MB-231细胞,通过Real-time PCR和Western blot分析转染si RNA对细胞内MTA1表达水平的影响。4.将MCF-7和MDA-MB-231细胞各分为四组,Control组为正常对照,Epi组接受6h表柔比星处理,Epi+NC si RNA组预转染NC si RNA后接受6h表柔比星处理,Epi+MTA1 si RNA组预转染MTA1特异性si RNA后接受6h表柔比星处理。通过划痕实验和transwell实验观察细胞的迁移和侵袭能力,观察MTA1抑制后表柔比星对乳腺癌细胞转移潜能的影响是否发生改变。5.建立小鼠4T1乳腺癌模型,实验组小鼠给予3mg/kg较低剂量表柔比星化疗,对照组小鼠给予生理盐水,每周给药1次,持续3周。比较两组小鼠肺表面转移灶数量,分析动物体内化疗对乳腺癌转移潜能的影响。结果:1.划痕实验中,表柔比星6h处理组的MCF-7和MDA-MB-231细胞,与对照组相比划痕愈合距离显著增加。Transwell实验中,6h处理组的MDA-MB-231细胞与对照组相比穿膜细胞数显著增加。12h处理组细胞中没有观察到这些效应。MCF-7细胞难以有效穿膜,transwell实验并未取得有意义的结果,后续实验不再考察MCF-7细胞的侵袭性。2.表柔比星处理后的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞均表现出MTA1 m RNA水平和蛋白水平的增高。3.与对照组和无意义NC si RNA组细胞相比,转染MTA1特异性si RNA可以显著降低MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中MTA1的m RNA水平和蛋白水平。4.在MCF-7和MDA-MB-231细胞的划痕实验中,与Control组细胞相比,Epi组/Epi+NC si RNA组细胞的划痕愈合距离显著增加;与Epi组细胞相比,Epi+MTA1si RNA组的划痕愈合距离显著减少。在MDA-MB-231细胞的transwell实验中,Epi组/Epi+NC si RNA组穿膜细胞数显著多于Control组,Epi+MTA1 si RNA组穿膜细胞数显著少于Epi组。5.在4T1乳腺癌小鼠的体内实验中,相比于对照组,给予表柔比星化疗的实验组小鼠有更多的肺表面转移灶形成。结论1.表柔比星处理可以在体外实验中增加乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力,这一效应受到药物处理时间的制约。处理时间过长会导致细胞严重损伤,无法观察到该效应。2.表柔比星处理可以显著提高乳腺癌细胞中MTA1的表达,而MTA1特异性si RNA可以有效抑制乳腺癌细胞中MTA1的表达。3.抑制MTA1可以部分抑制表柔比星处理引起的乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的增加。提示MTA1是表柔比星处理后肿瘤应激反应过程中的一个效应分子。4.小鼠体内低剂量表柔比星化疗可以促进4T1乳腺癌的肺转移。