论文部分内容阅读
目的：卵巢恶性肿瘤是妇科恶性肿瘤患者死亡的主要原因，多数卵巢恶性肿瘤患者就诊时已是晚期，对卵巢恶性肿瘤患者的治疗主要是手术和化学治疗。患者的预后很大程度上取决于对化疗的敏感性，但大部分癌细胞都会产生耐药，最终导致化疗失败，患者预后不良。对化疗耐药的研究发现卵巢恶性肿瘤耐药与多药耐药基因如GSTπ在卵巢恶性肿瘤中的高表达有关，为了克服化疗耐药，临床上需要加大抗癌药物的剂量，但超大剂量化疗（HDC）往往又会造成对骨髓的严重抑制。为了抵抗化疗药物对骨髓的抑制作用，本课题拟把耐药基因GSTπ导入造血干细胞(HSC)，增强造血系统对化疗的耐受性。本研究的目的是构建重组质粒pLXSN-GSTπ和建立一株稳定的产病毒包装细胞PA317/GSTπ，利用该包装细胞产生的逆转录病毒感染K562，研究GSTπ与CDDP、ADM和CTX耐药的关系，检测含有GSTπ基因的逆转录病毒感染K562的感染率，为GSTπ进一步应用于造血干细胞以提高造血系统对CDDP和ADM等抗癌药物的抵抗的研究奠定基础。方法：用限制性内切酶HpaⅠ、BamhⅠ分别双酶切质粒pLXSH-GSTπ和pLXSN，回收GSTπ小片段和pLXSN大片段，在T4连接酶的作用下，构建重组质粒pLXSN-GSTπ；酶切鉴定重组质粒pLXSN-GSTπ后，用脂质体和电穿孔两种转染方法转染PA317包装细胞，G418筛选获得抗性克隆，用宫颈癌细胞株Hela测定抗性克隆产生的病毒的滴度。在37℃条件下培养筛选出的最高病毒滴度的细胞株PA317/HGSTπ/B3-6，收集病毒上清，用过滤冻存后的病毒上清感染K562白血病细胞，SP法检测感染后的K562细胞中GSTπ蛋白的表达，MTT法测定转染后的K562对CDDP、ADM和CTX的敏感度。结果：1.酶切重组质粒pLXSN-GST﹡本课题获重庆市科委科研基金资助（2000-178）π，凝胶电泳酶切产物见目的片段DNA；2.利用脂质体和电穿孔两种转染方法将<WP=6>重组逆转录病毒载体pLXSN-GSTπ导入包装细胞PA317中，建立了双向性产病毒细胞株PA317/GSTπ/B3-6，其产生的病毒滴度为2.2×103，该逆转录病毒含有人全长GSTπcDNA。3.用逆转录病毒介导，通过病毒上清液连续4次感染，成功地将外源性耐药基因GSTπ转入K562的细胞中，用SP免疫组化法测得逆转录病毒的感染率为29%。4.MTT测得感染后的K562细胞具有多药耐药功能，GSTπ可提高K562细胞对CDDP、ADM和CTX的耐药性，与对照组的细胞存活率相比，感染后的K562细胞对CDDP、ADM和CTX的耐药性分别是对照组的2.49、3.00和3.19倍。结论：1.多药耐药基因GSTπ与治疗卵巢癌的一线抗癌药物CDDP、ADM和CTX的化疗耐药有关。2.利用逆转录病毒,本实验成功的把耐药基因GSTπ导入K562白血病细胞，该成功预示着运用逆转录病毒转染体系把GSTπ导入造血干细胞是一种可行的基因治疗方法。本课题为临床应用GSTπ基因转染造血干细胞，回输入患者体内，保护造血系统免遭化疗损害，从而为实施大剂量、冲击式化疗，提高卵巢恶性肿瘤根治率、降低卵巢恶性肿瘤复发率、延长患者的生存期以及提高患者5年生存率奠定了坚实的基础，对将来临床应用GSTπ基因治疗以提高包括卵巢癌在内的恶性肿瘤的治疗效果具有重要意义，对患者的有效治疗将具有重要的社会价值