研究背景腹主动脉瘤(Abdominal Aortic Aneurysm,AAA)是腹主动脉壁因局部病变或损伤等原因而向外膨出,形成的局段性永久性扩张,多发于老年男性,在65至79岁男性中发生率约为5-10%,吸烟、高血压、高脂血症、动脉粥样硬化等是导致腹主动脉瘤形成的重要原因。AAA一旦发生破裂其死亡率可高达90%,是世界范围内的重要死亡原因。动脉瘤切除人工血管置换术和腔内支架修复术是防止AAA破裂的有效途径,而达不到手术指征的患者则需长期随访复查,给患者带来巨大经济负担及长期的心理压力,目前临床上尚无有效控制腹主动脉瘤进展或将其逆转的药物。现在已有多项基于人群的研究报告显示,接受治疗的糖尿病患者其AAA患病率较低、动脉瘤生长速度及破裂几率也较低。二甲双胍(Metformin,Met)世界范围内是最常用的降糖药物,常作为2型糖尿病的一线药物治疗方案,有实验证据表明它除了降糖作用外还能影响多种机制,包括抑制炎症、抑制细胞外基质重塑和减少氧化应激等。Naoki Fujimura等对58名合并糖尿病的腹主动脉瘤患者的心血管危险因素及药物处方等进行逻辑回归分析,结果显示纠正了性别、年龄、吸烟状况和肥胖所带来的影响后,11种不同类型的药物治疗中只有二甲双胍的使用与AAA的扩大呈负相关,这就提示二甲双胍可能对腹主动脉瘤的发生及发展有抑制作用,但其具体机制尚不明确。磷脂酰肌醇 3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(Protein kinase B,AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路参与包括细胞生长、增殖、凋亡、自噬在内的多种细胞功能的调节。目前多数观点认为,AAA的形成、扩张、破裂与细胞外基质代谢失衡、组织缺氧、动脉粥样硬化、炎症和免疫反应、细胞凋亡、血压调节和血流动力学异常有关,而PI3K/AKT/mTOR信号通路与上述病理生理过程涉及的通路存在交联、对话。已有研究表明PI3K/AKT/mTOR信号通路在腹主动脉瘤中被激活,而抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活可以抑制腹主动脉瘤的发生发展。近年来大量实验证实Met能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制多种肿瘤的生长,而PI3K/AKT/mTOR信号通路是否参与Met对腹主动脉瘤抑制作用尚无研究报道,本研究主要分析研究Met抑制腹主动脉瘤生长的内在分子机制,以期为利用Met预防及治疗腹主动脉瘤提供实验依据。研究目的分析PI3K/AKT/mTOR信号通路在腹主动脉瘤组织中的激活情况,进一步明确其在腹主动脉瘤发生发展中的作用;利用血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang-Ⅱ)处理构建小鼠腹主动脉瘤模型,部分小鼠饮水中加入Met,通过对其成瘤率、动脉壁组织显微结构变化、动脉壁弹性纤维断裂情况、胶原纤维与肌纤维表达变化、组织细胞凋亡与自噬情况,以及细胞PI3K/AKT/mTOR通路激活情况的分析研究Met对腹主动脉瘤的抑制作用;体外以大鼠胸主动脉平滑肌细胞VSMCs为实验细胞,探究Met对Ang-Ⅱ引起的VSMCs增殖、凋亡、细胞周期阻滞、自噬、迁移以及PI3K/AKT/mTOR通路激活的作用,同时加入PI3K抑制剂(LY294002)与激活剂(740 Y-P),深入分析PI3K/AKT/mTOR信号通路在其中的作用;设计合成沉默自噬相关基因7(Autophagy-related gene 7,Atg7)的siRNA(si-Atg7),并构建 Atg7 过表达质粒(OE-Atg7),转染 VSMCs,进一步研究Met对VSMCs自噬调节的可能分子机制。研究方法第一章:Met通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路与自噬抑制小鼠腹主动脉瘤的发生发展。招募腹主动脉瘤患者,在手术过程中,收集并保存腹主动脉瘤组织。以正常的腹主动脉组织为对照,利用蛋白质免疫印迹实验(Western blotting)检测PI3K、AKT、mTOR以及其磷酸化形式p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达水平。将Apolipoprotein E基因敲除(ApoE-/-)小鼠皮下植入灌有Ang-Ⅱ溶液的微量渗透泵,通过持续泵注Ang-Ⅱ建立小鼠腹主动脉瘤模型,部分小鼠饮水中加用Met。实验分为假手术组(Sham组,微量渗透泵内注生理盐水),模型组(AAA组,通过微渗透泵持续泵注入Ang-Ⅱ,1.44 mg/Kg/天)以及Met处理组(AAA+Met组,通过微渗透泵持续泵注入Ang-Ⅱ,1.44 mg/Kg/天,并在饮水中加入Met,100mg/Kg/d)。28天后,利用多普勒超声检测腹主动脉最大直径;小鼠给予戊巴比妥钠吸入麻醉后取出腹主动脉组织。分别利用苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色、EVG 染色、Masson 染色以及天狼猩红(Sirius Red)染色观察腹主动脉组织显微结构变化、弹性纤维断裂情况、胶原纤维与肌纤维表达变化、胶原纤维的纤维化状态;采用Tunel染色观察腹主动脉细胞凋亡情况;采用免疫组化实验分析血小板-内皮细胞粘附因子(Platelet endothelial cell adhension molecule-1,PECAM-1/CD31,CD31)与分化抗原群 68(Cluster of differentiation,CD68)表达水平以评估动脉瘤壁新生血管情况与巨噬细胞浸润情况;免疫组化实验分析基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2,MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达水平以评估动脉壁细胞外基质降解情况;免疫组化实验分析PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、微管相关蛋白轻链 3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3B)以及 Beclin 1 表达水平;利用 Western blot 检测 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3B以及Beclin 1蛋白质表达水平;利用qRT-PCR检测腹主动脉组织PI3K、AKT、mTOR、LC3B 以及 Beclin 1 mRNA 表达水平。第二章:体外探讨Met对Ang-Ⅱ作用大鼠主动脉平滑肌细胞功能的影响以大鼠胸主动脉平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)为实验细胞。实验分为Control组(正常培养的VSMCs),Ang-Ⅱ组(1μM Ang-Ⅱ处理);Ang-Ⅱ+Met 组(1 μM Ang-Ⅱ+10 mM Met 处理),Ang-Ⅱ+Met+LY294002组(1 μM Ang-Ⅱ+10 mM Met+10 μM LY294002 处理),Ang-Ⅱ+Met+740 Y-P组(1 μM Ang-Ⅱ+10 mM Met+25 mM 740Y-P 处理)。利用 EdU 染色检测VSMCs增殖活性;采用Annexin V-FITC与PI双染结合流式细胞仪检测VSMCs凋亡情况;PI单染结合流式细胞仪被用于检测VSMCs周期分布情况;利用透射电镜观察VSMCs自噬小体变化;采用免疫荧光实验分析VSMCs中α-SMA和LC3B的表达;划痕实验和Transwell实验被用于检测VSMCs迁移能力;利用qRT-PCR 检测 VSMCs 中 PI3K、AKT、mTOR、LC3B 以及 Beclin 1 mRNA 表达水平;利用 Western blotting 检测 Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3B以及Beclin 1蛋白质表达水平。第三章:Met通过抑制Atg7表达缓解Ang-Ⅱ引起的VSMCs自噬以VSMCs为实验细胞,利用Western blotting检测Ang-Ⅱ与Met处理后,自噬相关基因4(Autophagy-related gene 4,Atg4)与自噬相关基因7(Autophagy-related gene 7,Atg7)的表达变化。设计合成沉默Atg7表达的siRNA(si-Atg7),并构建Atg7过表达质粒(OE-Atg7),分别转染VSMCs。利用免疫荧光实验检测Atg7表达水平;Western blotting实验检测Atg7、LC3B、Beclin 1蛋白表达水平。对转染了 OE-Atg7的VSMCs分别给予Ang-Ⅱ与Met处理,免疫荧光实验检测Atg7表达水平;Western blotting实验被用于检测Atg7、LC3B、Beclin 1蛋白表达水平。结果第一章:Met通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路与自噬抑制小鼠腹主动脉瘤的发生发展与正常的腹主动脉组织相比,p-PI3K与PI3K的蛋白表达比例(p-PI3K/PI3K)、p-AKT与AKT的蛋白表达比例(p-AKT/AKT)、p-mTOR与mTOR的蛋白表达比例(p-mTOR/mTOR)在腹主动脉瘤组织中均有显著提高(P<0.05或P<0.01)。与Sham组小鼠相比,AAA组小鼠的腹主动脉最大直径显著升高(P<0.01);Met处理明显抑制小鼠腹主动脉直径的增大(P<0.01)。各组小鼠的腹主动脉瘤形成率分别为:Sham组0%、AAA组78%、AAA+Met组25%。HE染色发现与Sham组相比,AAA组小鼠的腹主动脉壁明显增厚,动脉中膜和外膜的浸润性细胞增多;而Met处理能够改善这一现象。EVG染色发现与Sham组相比,AAA组小鼠的腹主动脉壁弹性纤维明显变少并存在断裂现象,且失去了原有的凹凸形态;而AAA+Met组小鼠腹主动脉壁弹性纤维较AAA组要多且不存在断裂现象,仍表现为凹凸状。Masson染色发现AAA组小鼠腹主动脉中的胶原纤维明显变粗,细胞排列混乱且分布不均,肌纤维含量增多;而Met处理能够改善这一现象。Sirius Red染色发现AAA组小鼠腹主动脉组织胶原纤维纤维化程度增高;Met处理同样能够改善这一现象。Tunel染色发现Met能够减少Ang-Ⅱ引起的小鼠腹主动脉组织细胞凋亡。免疫组化实验发现AAA组小鼠腹主动脉组织 CD31、CD68、MMP-2、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、LC3B 以及 Beclin 1表达水平升高(P<0.01);Met处理显著降低CD31、CD68、MMP-2、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、LC3B 以及 Beclin 1 表达(P<0.01)。qRT-PCR 实验发现AAA组小鼠腹主动脉组织LC3B与Beclin 1 mRNA表达明显升高(P<0.01);Met 处理能够降低 LC3B 与 Beclin 1 mRNA 表达(P<0.01)。Western blotting实验发现AAA组小鼠腹主动脉组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、LC3B-Ⅱ与LC3B-Ⅰ蛋白表达比例(LC3B-Ⅱ/Ⅰ)以及Beclin 1的蛋白表达水平明显升高(P<0.01),Met能够显著缓解这一现象(P<0.05或P<0.01)。第二章:体外探讨Met对Ang-Ⅱ作用大鼠腹主动脉平滑肌细胞功能的影响Ang-Ⅱ处理显著增强VSMCs增殖活性(P<0.01),提高VSMCs在S期的分布(P<0.01);Met孵育能够抑制VSMCs增殖(P<0.05),减低VSMCs在S期的分布(P<0.01);LY294002能够增强Met对VSMCs增殖的影响(P<0.05),而740 Y-9能够降低Met对VSMCs增殖与S期分布的影响(P<0.05或P<0.01)。Ang-Ⅱ处理后,VSMCs凋亡比例升高(P<0.01),伴随着凋亡促进蛋白Bax表达水平的升高和凋亡抑制蛋白Bcl-2表达水平的降低;Met处理能够降低VSMCs凋亡比例(P<0.01)、降低Bax表达,并提高Bcl-2表达;LY294002 能够提升 Met 对 VSMCs 凋亡(P<0.05)、以及 Bax、Bcl-2 表达的影响,而740Y-9具有相反的作用(P<0.01)。透射电镜实验观察到Ang-Ⅱ处理能够提高VSMCs中自噬小体的数量,免疫荧光实验发现Ang-Ⅱ处理能够提高VSMCs中LC3B的表达;Met孵育能够减少VSMCs中自噬小体的数量并降低LC3B的表达;加入LY294002后,自噬小体数量进一步降低,伴随着LC3B表达的减少;而加入740 Y-9后,自噬小体数量升高,LC3B的表达也升高。划痕实验和Transwell实验发现Ang-Ⅱ处理明显提升VSMCs迁移能力(P<0.01),Met能够抑制VSMCs迁移(P<0.01);LY294002能够增强Met对VSMCs迁移的抑制能力(P<0.05),而740Y-P具有相反的作用(P<0.01)。qRT-PCR实验发现Ang-Ⅱ处理后VSMCs中LC3B与Beclin 1 mRNA表达明显升高(P<0.01),Met处理能够降低LC3B与Beclin 1 mRNA表达(P<0.01);加入LY294002后,LC3B与Beclin 1 mRNA表达进一步被抑制(P<0.05或P<0.01),而加入 740Y-P 后,LC3B 与 Beclin l mRNA 表达升高(P<0.01)。Western blotting 实验发现 Ang-Ⅱ 处理后 VSMCs 中 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、LC3B-Ⅱ/Ⅰ以及Beclin 1的蛋白表达水平明显升高(P<0.01),Met 能够显著降低 VSMCs 中 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、LC3B-Ⅱ/Ⅰ以及Beclin 1的蛋白表达(P<0.01);LY294002能够增强Met的作用(P<0.05或P<0.01),而740Y-P能够降低Met的作用(P<0.01)。第三章:Met通过抑制Atg7表达缓解Ang-Ⅱ引起的VSMCs自噬Ang-Ⅱ处理显著升高VSMCs中Atg4与Atg7的蛋白表达水平,Met孵育能够降低Atg4与Atg7的表达水平。si-Atg7转染后,VSMCs中Atg7表达明显降低;而OE-Atg7转染后,Atg7表达明显升高。过表达Atg7增强Ang-Ⅱ引起的VSMCs自噬,以及LCB Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1表达水平升高;沉默Atg7表达具有相反的作用。Met处理显著降低VSMCs中Atg7的表达,并抑制LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1表达。结论本研究首先分析了 PI3K/AKT/mTOR信号通路在腹主动脉瘤临床样本中的表达;通过利用Ang-Ⅱ建立小鼠腹主动脉瘤模型,探讨了 Met对腹主动脉瘤的抑制作用;最后以VSMCs为实验细胞,进一步分析了 Met抗腹主动脉瘤的分子机制。首次通过完整的动物及细胞实验探究了 Met对AAA的抑制作用及其分子机制。深入研究Met作用后PI3K/AKT/mTOR信号通路、自噬、动脉壁显微结构、平滑肌细胞功能的变化,为后续药物治疗提供理论基础。主要得到以下结论:1.PI3K/AKT/mTOR信号通路在腹主动脉瘤组织中被激活;2.Met明显减低Ang-Ⅱ诱导的ApoE-/-小鼠腹主动脉瘤的发生率,改善小鼠腹主动脉壁增厚、动脉中膜和外膜浸润性细胞增多、动脉壁弹性纤维减少与断裂、胶原纤维的改变、组织细胞的凋亡与自噬、抑制组织细胞PI3K/AKT/mTOR通路的激活;3.Met缓解Ang-Ⅱ引起的VSMCs增殖、S期周期阻滞、凋亡、自噬、迁移,并抑制Ang-Ⅱ引起的VSMCs中PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活;VSMCs中PI3K/AKT/mTOR信号通路的失活参与Met对由Ang-Ⅱ引起的VSMCs增殖、S期周期阻滞、凋亡、自噬与迁移的缓解作用。4.Met缓解Ang-Ⅱ引起的VSMCs中Atg4与Atg7表达水平的升高;过表达Atg7增强Ang-Ⅱ引起的VSMCs自噬;抑制Atg7表达具有相反的作用;Met通过抑制Atg7表达缓解Ang-Ⅱ诱导的VSMCs自噬。