转ScALDH21基因棉花的获得及耐盐性鉴定

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棉花在我国经济作物中占据着非常关键的战略地位,分子育种技术不仅可以缩短棉花育种周期,还可以从单一或多方面的提高棉花抗性。本研究分别在新疆农垦科学院、新疆农科院经济作物研究所早熟棉课题组玛纳斯基地和中国彩棉公司库尔勒彩棉基地选取六个棉花候选品种作为受体,分别为180097(农垦科学院1个)、新农棉1号、109和ZY17-1(农科院3个)、绿棉2100和棕棉2105(彩棉公司2个),将从极端耐旱的苔藓植物-齿肋赤藓克隆得到的ScALDH21基因,分别构建至包含卡那霉素和除草剂抗性标记载体中,利用农杆菌介导的喷花法转化至棉花中。结合叶片涂抹表型鉴定法和PCR分子鉴定法,确定转化株系;统计并比较转化效率;分析该基因在基因组中的插入位置,最终获得稳定遗传的转化体棉花新材料。同时,对T4代转化体材料进行了盐胁迫实验,分别在大田条盆及温室盆栽条件下,在苗期对转化体进行盐胁迫处理。大田条盆试验中,分别统计0.4%、0.5%和0.6%盐土栽种下转ScALDH21基因与对照组棉花的叶绿素含量和存活率,并测定其净光光合速率、气孔导度、蒸腾速率及瞬时水分利用效率;室内盆栽试验中,分别统计Na Cl(150 m M)和清水处理下不同棉花株系丙二醛(MDA)、过氧化物酶(POD)、木质素、Na+、K+及Na+/K+值。主要结果如下:(1)构建具有卡那霉素抗性和除草剂标记的携带ScALDH21外源基因的两套载体(p CAMBIA2300和p CAMBIA3301),利用农杆菌介导的喷花法,分别转化新疆候选主栽彩色棉和白棉品种,经统计,得到基因转化后棉花座果率分别为:32.8%(180097)、46.6%(新农棉1号)、54.8%(109)、29.7%(ZY17-1)、18%(绿棉2100)和10%(棕棉2105),将部分T0代种子进行海南南繁,采用5000 ppm卡那霉素和2000 ppm草甘膦溶液涂抹棉花叶片,筛选抗性植株,经计算得到大田阳性植株的卡检率为8.3%(180097)、6.9%(新农棉1号)、0.6%(109)、29.4%(ZY17-1)。由于彩棉未在海南加代繁殖,所以选择室内进行种植,阳性卡检率为17.6%(绿棉2100)和19.3%(棕棉2105)。最终得到转基因植株180097(3株)、新农棉1号(4株)、109(1株)、ZY17-1(11株)、绿棉2100(1株)和棕棉2105(6株);最终转化率分别为0.098%、0.170%、0.047%、0.288%、0.076%和0.222%。(2)以新农棉1号的T4代2个转ScALDH21基因棉花株系为实验材料,分别在大田条盆及温室盆栽条件下进行苗期转ScALDH21基因棉花的盐胁迫实验。大田条盆盐胁迫实验中,在0.6%的盐胁迫下转ScALDH21基因棉花L92株系存活率、叶绿素相对含量显著高于对照组;在0.6%盐胁迫下,L92株系叶片的净光合速率气、气孔导度和蒸腾速率显著高于对照组;在0.5%盐胁迫下,L92和L96的瞬时水分利用效率显著高于与对照组。室内盆栽,在150m M盐胁迫条件下,L92株系的MDA含量显著低于非转基因棉花;L96的POD酶活性显著高于对照组;L92和L96的的木质素含量显著高于非转基因棉花;L92和L96的Na+/K+显著低于对照组。综合以上分析,本实验从形态及生理指标层面验证了转ScALDH21基因棉花在苗期提高了植株的耐盐性。(3)初步确定了高代转ScALDH21基因棉花外源基因在染色体上的插入位置。在基因组数据库Phytozome下载棉花(Gossypium hirsutum)基因组。基于基因组序列文件和注释文件,使用TBtool s-GXF sequences Extract进行基因序列提取,得到本地棉花基因序列库。以ScALDH21基因3’端侧翼序列为比对序列,以提取的陆地棉棉花基因序列库作为目标序列进行序列比对。与陆地棉基因组序列进行BLSATN比对分析,其中607 bp与陆地棉A13染色体的G089700基因(dehydrogenase/re ductase SDR family member 7 isoform)序列片段相似性达到99%,位于4307 bp处。
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