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卵巢是女性生育调控的中心,也是衰老最迅速的器官之一。高龄伴随着卵巢内卵泡数目和质量的减退,但其中的机制并不完全明确,可能与卵泡闭锁加速,原始卵泡池缩小等有关。卵巢储备功能下降(Decreased ovarian reserve,DOR)是指卵巢内存留的可募集卵泡数量减少、卵子的质量下降,导致性激素分泌不足或缺失和女性生育能力下降,进一步可发展为卵巢功能衰竭,临床上以抗缪勒氏管激素(AMH)和窦卵泡数(AFC)下降,基础促卵泡激素(bFSH)升高为特征,且随年龄增加,DOR的发生发展明显加速。卵泡是卵巢的基本功能单位,由卵母细胞和周围的颗粒细胞构成。研究表明卵母细胞的发育成熟过程高度依赖于颗粒细胞和卵母细胞之间的双向对话。线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所。卵巢颗粒细胞中含有丰富的线粒体,可将胞质中的葡萄糖代谢为丙酮酸,并转运到卵母细胞中用以产生ATP,维持卵母细胞的发育。随着年龄增长,颗粒细胞中线粒体形态发生改变,线粒体膜电位下降,合成ATP的水平显著降低,颗粒细胞的凋亡增加,可能影响卵母细胞的功能,或引起卵巢储备能力的改变。本研究首先通过收集人卵泡颗粒细胞,探索高龄女性线粒体功能的改变,并跟踪其助孕结局,阐明颗粒细胞与卵母细胞结局的相关性。其次选择44~48周龄的高龄小鼠作为实验模型,探索随小鼠周龄变化,卵巢中颗粒细胞线粒体动力蛋白和自噬功能的改变,以期明确其对颗粒细胞/卵母细胞凋亡的影响,从而为高龄助孕患者卵母细胞质量改善提供新措施。第一部分为人卵泡颗粒细胞试验,主要包括:1.通过qRT-PCT检测适龄组(<38岁)、高龄组(38~41岁)和超高龄组(≥42岁)人卵泡颗粒细胞线粒体相关因子在m RNA水平的变化,结果显示P62、PINK和PARKIN在适龄组和38~41岁高龄组无显著差异,但在适龄组和超高龄组具有显著差异(P<0.05);2.对照分析不同年龄段卵母细胞受精、胚胎形成以及临床妊娠情况,统计结果显示三组人群的获卵率、受精率具有显著性差异(P<0.05),但形成胚胎率、优胚率、生化妊娠率、临床妊娠率三组无显著差异。第二部分为高龄小鼠生殖力实验,选择适龄(6~8周龄)和高龄(44~48周龄)雌鼠为研究对象:1.按1:1分别与适龄雄鼠配对,记录两组雌鼠平均产仔数量,统计显示高龄小鼠产仔数量明显下降;2.HE染色观察两组雌鼠卵巢组织学变化发现适龄小鼠卵巢形态结构完整,各级卵泡发育良好,高龄小鼠卵巢组织纤维化加重,各级卵泡发育不良且数量明显减少,闭锁卵泡数量明显增多;3.通过免疫荧光染色技术观察两组雌鼠卵巢颗粒细胞线粒体膜电位及其凋亡情况:与适龄小鼠相比,高龄小鼠卵巢颗粒细胞大多呈绿色荧光,几乎无红色荧光,表明高龄小鼠颗粒细胞线粒体膜电位下降;高龄小鼠颗粒细胞中FITC+和PI+的比例皆显著增多,说明细胞凋亡增多;4.通过qRT-PCT、蛋白印迹法、免疫组化检测两组雌鼠卵巢颗粒细胞线粒体动力相关蛋白Drp1和Opa1、自噬标记因子LC3与P62在mRNA及蛋白水平的变化,高龄小鼠卵巢颗粒细胞中Drp1、LC3和P62在mRNA和蛋白水平上表达均显著增加(P<0.01),Opa1仅在蛋白表达水平上显著增加(P<0.05);5.通过qRT-PCT、蛋白印迹法检测两组雌鼠卵巢颗粒细胞中PINK、Parkin在mRNA及蛋白水平变化,高龄小鼠卵巢颗粒细胞中PINK(P<0.001)和Parkin(P<0.05)在mRNA和蛋白水平上表达均显著增加。以上研究结果显示,人超高龄组女性卵泡颗粒细胞线粒体自噬受损,伴随着卵母细胞受精后结局不良,表明颗粒细胞线粒体功能受损会影响卵母细胞质量,降低生育力。高龄小鼠卵巢颗粒细胞线粒体裂变融合受到影响,同时线粒体自噬水平增高;降低的线粒体膜电位会启动线粒体的PINK1-Parkin自噬通路,使线粒体的自噬水平显著升高。上述改变可能导致线粒体功能发生障碍,从而引起高龄小鼠颗粒细胞凋亡增多,进而使卵泡中卵母细胞凋亡加速,这可能是使卵巢的储备降低导致生育力下降的原因之一。