急性脊髓损伤是严重致残性疾病,可导致患者的运动功能障碍,严重的后遗症和并发症给患者个人和家庭以及社会带来巨大的经济负担。急性脊髓损伤包括原发性脊髓损伤和继发性脊髓损伤。继发性脊髓损伤导致原发性脊髓损伤对脊髓的伤害进一步加剧,但这个过程又是具有可逆性和可调控性的,因此对继发性脊髓损伤的转归对脊髓神经的修复和再生具有非常重要的价值和意义。目前,对急性脊髓损伤治疗的关键点集中在继发性脊髓损伤病理反应和机制的研究。自噬(autophagy)是由Ashford和Porter在1962年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的,是胞内形成双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome),并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。在脊髓损伤中,神经元作为终末分化细胞,自噬的发生显得尤为重要。近年来,越来越多的研究集中到脊髓损伤后自噬的发生以及作用机制。第一章急性脊髓损伤模型的建立[摘要]目的制作脊髓损伤模型,为脊髓损伤后神经再生和修复提供良好的观察模型。方法采用SPF级Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠),成年雄性,体重在200-250g之间,分为正常的脊髓,损伤后4h(小时)、1d(天)、3d、7d、21d、60d和90d几个小组,每个小组8只动物,实验动物给予10%戊巴比妥钠300mg/kg的腹腔注射麻醉。制作右侧半横切的急性脊髓损伤模型。采用HE染色和甲苯胺蓝染色进行脊髓损伤后病理学检测,利用BBB评分法评价损伤后动物的运动功能。结果在急性脊髓损伤动物模型制作过程和制作后会出现部分动物死亡的现象,死亡的动物及时给与补充。HE病理学检测显示正常脊髓切片,神经元和胶质细胞均匀分布,细胞胞体饱满,细胞核和细胞质界限明显。脊髓损伤的组织切片内出现大量的空腔,空腔内存在坏死组织碎片,细胞组织内出现液化坏死。白质内出现组织广泛水肿的现象,呈海绵状。脊髓损伤3d后,大鼠右后侧肢体瘫痪,无运动,BBB评分平均值为0.7分；随着损伤时间的延长,大鼠脊髓的运动有部分功能的恢复,在损伤后60d和90d,大鼠后肢的三个关节存在轻微的活动,有些甚至出现两到三个关节的广泛运动,经BBB评分平均值为6.8分。结论右侧半横切的急性脊髓损伤模型不但能造成模型动物的感觉和运动的半边瘫痪,同时为脊髓损伤后神经再生和修复提供了良好的观察模型。[摘要]目的探讨脊髓损伤后自噬的发生和自噬流的动态过程,并确定自噬在脊髓损伤后神经元和胶质细胞的定位。方法制作半横切的急性脊髓损伤模型,损伤后4h、1d、3d、7d、21d,利用Western和免疫组织化学检测方法检测自噬相关蛋白Beclinl、LC3的表达,利用RT-PCR检测Beclinl mRNA的表达,透射电镜检查损伤后自噬小体的形成。利用West(;rn检测方法检测自噬底物蛋白p62的表达,并利用免疫组织化学检测方法检测自噬和神经元、胶质细胞的共定位。结果经过Western条带的密度扫描分析和免疫组织化学检测,脊髓损伤后4h LC3和Beclinl蛋白的表达量较正常对照的脊髓组织有所提高,随着时间的延长,两者的表达量也随着升高,在脊髓损伤的3d达到表达量的高峰期,在7d和21d表达量逐渐降低,但较正常对照组仍有所升高。经过透射电镜观察,我们发现正常对照的脊髓组织结构显示正常,髓鞘呈同心圆排列,层间排列结合紧密。脊髓损伤后4h,我们发现神经出现脱髓鞘现象,层间的排列发生紊乱,出现大量空泡。经Western检测显示,脊髓损伤4h后自噬底物p62的表达量较正常对照组织有所下降,并随着损伤进程的进行,表达量逐渐降低,1d、3d、7d和21d均较正常对照组织有大量的降低,较正常对照的脊髓组织表达量的差异有统计学意义,P<0.05。经过共定位发现,脊髓损伤后自噬发生于神经元和胶质细胞中。结论脊髓损伤后神经组织发生了自噬,并且随着损伤病理的进程,自噬的活性不断增强,在3d达到了高峰期。自噬的过程不仅发生于脊髓组织的神经元,同时也发生于胶质细胞中,提示自噬的活动对脊髓损伤的病理活动存在一定的影响。第三章脊髓损伤后自噬发生的作用[摘要]目的探讨急性脊髓损伤后,自噬活动的发生对脊髓功能恢复的作用。方法采用自噬抑制剂3-MA和自噬增强剂Rapamycin腹腔注射脊髓损伤后的大鼠,于损伤后4h,1d、3d、7d、21d通过Western和免疫组织化学检测方法检测自噬相关蛋白Beclinl、LC3的表达,并利用BBB评分法检测自噬抑制和增强后对脊髓神经功能的恢复作用。结果经过Western和免疫组织化学检测,我们发现单纯的脊髓损伤组各个时间点的Beclinl和LC3B的表达较正常对照组均有所提高。3-MA组中,B eclinl和LC3B的表达在脊髓损伤4h、1d、3d、7d和21d后较单纯的脊髓损伤组有所下降,且差异具有统计学意义,Rapamycin组中,Beclinl和LC3B的表达在脊髓损伤4h, Id、3d、7d和21d后较单纯的脊髓损伤组有所升高,且差异具有统计学意义,P<0.05。经过免疫组织化学的LC3和1AP-2、 GFAP的共定位,3-MA组中,神经元和胶质细胞中的自噬的表达在4h、1d、3d、7d和21d逐渐降低,较单纯的脊髓损伤组有所下降,且差异具有统计学意义,P<0.05。Rapamycin组中,神经元中和胶质细胞的自噬的表达在4h、1d、3d、7d和21d逐渐升高,较单纯的脊髓损伤组有所提高,且差异具有统计学意义,P<0.05。经BBB评分,抑制自噬能阻碍脊髓损伤大鼠的运动功能的恢复,增强自噬能促进脊髓损伤大鼠的运动功能的恢复。结论脊髓损伤后,3-MA能够抑制自噬的发生,Rapamycin能够促进自噬的发生。3-MA能够抑制噬神经元和胶质细胞的发生,Rapamycin能够促进神经元和胶质细胞自噬的发生。抑制自噬能阻碍脊髓损伤大鼠的运动功能的恢复,增强自噬能促进脊髓损伤大鼠的运动功能的恢复。第四章脊髓损伤自噬对神经功能修复的作用机制[摘要]目的探讨急性脊髓损伤后,自噬过程对脊髓神经功能修复的作用机制。方法采用自噬抑制剂3-MA和自噬增强剂Rapamycin腹腔注射脊髓损伤后的大鼠,于损伤后4h、1d、3d、7d、21d通过免疫组织化学技术检测凋亡指示蛋白activated caspase-3表达,通过Western检测凋亡相关蛋白Bcl-2、BAX的表达,并利用BBB评分法检测自噬抑制和增强后对脊髓神经功能的恢复作用。结果经凋亡表达的marker蛋白activated caspase-3与脊髓组织神经元的marker蛋白MAP2及胶质细胞的marker蛋白GFAP的免疫组织化学共定位发现,3-MA组中,activated caspase-3在损伤脊髓组织中的表达量在脊髓损伤4h、1d、3d、7d和21d后较单纯的脊髓损伤组有所上升,且差异具有统计学意义,P<0.05。 Rapamycin组中,activated caspase-3的表达在脊髓损伤4h、1d、3d,7d和21d后在损伤脊髓组织中的表达量较单纯的脊髓损伤组有所下降,且差异具有统计学意义,P<0.05。经过Western检测,我们发现单纯的脊髓损伤组各个时间点的Bcl-2的表达较正常对照组均有所提高。3-MA组中,Bcl-2的表达在脊髓损伤4h、1d、3d、7d和21d后较单纯的脊髓损伤组有所下降,且差异具有统计学意义, P<0.05。Rapamycin组中,Bcl-2的表达在脊髓损伤4h、1d、3d、7d和21d后较单纯的脊髓损伤组有所升高,且差异具有统计学意义,P<0.05。经过Western检测,我们发现单纯的脊髓损伤组各个时间点的BAX的表达较正常对照组均有所下降。3-MA组中,BAX的表达在脊髓损伤4h、1d、3d、7d和21d后较单纯的脊髓损伤组有所上升,且差异具有统计学意义,P<0.05。Rapamycin组中,BAX的表达在脊髓损伤4h、1d、3d、7d和21d后较单纯的脊髓损伤组有所下降,且差异具有统计学意义,P<0.05。结论脊髓损伤后,自噬的抑制能够诱发神经元和胶质细胞的凋亡,自噬的增强能够抑制神经元和胶质细胞的凋亡；自噬的抑制能够抑制Bcl-2的表达,促进BAX的表达,自噬的增强能够促进Bcl-2的表达,抑制BAX的表达。