【摘 要】
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目的1.利用hEMSC、hADSC及hUCMSC的条件培养基获取外泌体,并鉴定比较;2.建立合适的成纤维细胞氧化应激模型;3.为了研究hEMSC、hADSC及hUCMSC的条件培养基对氧化应激损伤的成纤维细胞的作用。方法1.hEMSC由酶消子宫内膜组织获取并培养鉴定,培养扩增hADSC及hUCMSC,进而获取他们的条件培养基,使用外泌体提取试剂盒与超高速差速离心法两种方式提取hEMSC源性外泌体以
【基金项目】
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山西省自然科学基金“ EMSCs微泡介导HOXA11调控Keap1-Nrf2/ARE治疗POP的机制研究（编号:201901D111366）；
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目的1.利用hEMSC、hADSC及hUCMSC的条件培养基获取外泌体,并鉴定比较;2.建立合适的成纤维细胞氧化应激模型;3.为了研究hEMSC、hADSC及hUCMSC的条件培养基对氧化应激损伤的成纤维细胞的作用。方法1.hEMSC由酶消子宫内膜组织获取并培养鉴定,培养扩增hADSC及hUCMSC,进而获取他们的条件培养基,使用外泌体提取试剂盒与超高速差速离心法两种方式提取hEMSC源性外泌体以及超高速差速离心法提取hADSC及hUCMSC间充质干细胞源性外泌体并通过NTA分析粒径大小及浓度、TEM镜下观察外泌体形态鉴定外泌体,并通过BCA测定蛋白浓度等方式比较各组外泌体的蛋白含量;2.为建立合适的氧化应激模型,先确定合适的DCFH-DA探针的浓度;通过不同浓度的H2O2溶液刺激成纤维细胞后流式细胞术测定各组成纤维细胞的ROS荧光强度;并对刺激后的成纤维细胞进行活/死细胞染色,确定合适的H2O2溶液浓度;3.确定以100μM H2O2溶液刺激成纤维细胞1小时为合适的氧化应激模型;用无血清DMEM基础培养基、hEMSC、hADSC及hUCMSC的条件培养基对无损伤或损伤后的成纤维细胞进行孵育,24小时后流式细胞术测定各组成纤维细胞的ROS荧光强度。4.统计学方法:采用SPSS 22.0软件分析原始数据,所有数据以均数+标准差形式描述,采用单因素方差分析组间差异,实验组与对照组的差异显著性采用两独立样本t检验进行描述。结果1.成功分离hEMSC、hADSC及hUCMSC源性外泌体,NTA测定的外泌体大小均在100-150nm之间,TEM镜下观察显示外泌体呈双膜样囊泡结构,有典型的茶托样;BCA蛋白浓度测定显示超高速离心法hEMSC源性外泌体蛋白浓度最高（P<0.05）;超高速离心法hUCMSC源性外泌体蛋白浓度最低（P<0.05）;2.确定8μM DCFH-DA探针为后续实验中的探针浓度,采用100μM的H2O2溶液刺激成纤维细胞1小时作为成纤维细胞的氧化应激模型,作为后续实验的研究模型;3.实验结果显示,用100μM H2O2刺激成纤维细胞1小时后直接测ROS水平相对于空白对照组是升高的,经过24小时各组基础培养液或条件培养基的孵育发现,用无血清DMEM培养液孵育降低了受损成纤维细胞的ROS荧光强度,但是hEMSC、hADSC及hUCMSC条件培养基孵育增加了成纤维细胞ROS的水平,以hUCMSC条件培养基为显著差异。结论经过hEMSC、hADSC及hUCMSC的条件培养基孵育H2O2刺激成纤维细胞后,受损的成纤维细胞ROS荧光强度大幅度的增加,说明hEMSC、hADSC及hUCMSC的条件培养基加剧了成纤维细胞的氧化应激损伤。
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