前言目前认为,氧自由基及其引起的脂质过氧化是缺血再灌注损伤的重要机制之一,脑组织缺血再灌注脑组织损伤的病理过程中,氧自由基可损伤蛋白质、脂质、核酸等,可直接作用于生物膜上的不饱和脂肪酸,损伤生物膜,由于体内氧化系统被激活,氧自由基大量生成,引发脂质过氧化反应,蛋白质变性失活,膜屏障功能严重受损,导致细胞死亡。作为缺血脑组织神经细胞损伤和血脑屏障损伤的重要介质,氧自由基会加重缺血性脑卒中病理过程中脑水肿、缺血后出血和组织坏死的发生发展。在脑组织缺血再灌注损伤的病理过程中,氧自由基的来源有多种途径,许多细胞中,NADPH（还原型辅酶Ⅱ,即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）氧化酶是过氧化物产生的一个主要因素之一,与氧自由基的病理作用关系密切。大量实验证据表明,缺血脑组织中NADPH氧化酶的表达上调,与缺血性脑卒中后的神经元死亡有关。最近研究证实,NADPH氧化酶催化亚单位gp91phox与缺血性脑卒中等疾病密切相关,NADPH氧化酶是神经组织和脑血管系统中氧自由基产生的一个重要途径,氧自由基的过度产生引起脂质过氧化反应从而破坏血脑屏障的完整性。最近研究显示gp91phox基因敲除小鼠的缺血性血脑屏障损伤比野生型小鼠显著地减轻,表明NADPH氧化酶在缺血性血脑屏障损伤中有重要作用。缺血性卒中研究中,氧自由基O2·-的过度生成被认为是MMP-9（基质金属蛋白酶-9）诱导表达的因素之一,也是血脑屏障（BBB）损伤的重要原因,氧自由基除对BBB有直接氧化损伤之外,也是缺血脑组织MMP-9诱导表达的重要触发因素,而MMP-9介导蛋白水解而降解BBB结构成分。大量实验资料表明,在缺血再灌注脑组织损伤中MMP-9介导的蛋白水解作用导致血脑屏障结构成分的降解,氧自由基参与缺血脑组织MMP-9的诱导表达,在SOD1转基因鼠（SOD过度表达）的缺血脑组织中,MMP-9的诱导表达明显减少,血脑屏障损伤明显减轻。研究显示在血管系统中,NADPH氧化酶介导的氧自由基产生参与MMP-2和MMP-9的激活。但是,到目前为止,还没有资料报道在缺血性脑卒中脑组织中NADPH氧化酶对MMP-9表达的调节作用。E-选择素是一种诱导性黏附分子,具有介导活化的内皮细胞与中性粒细胞黏附的作用,并直接参与炎性细胞的聚集和浸润。脑缺血再灌注损伤时,粘附分子介导白细胞的贴壁、粘附和转移,使白细胞经内皮细胞游出血管内壁,并释放大量组织炎性因子等,在白细胞与内皮细胞紧密粘附及白细胞跨内皮转移时,粘附局部缺氧,可激活内皮细胞产生氧自由基,损伤血管内皮细胞,同时,氧自由基又可增强内皮对白细胞的粘附,释放更多的炎性因子,脑缺血后缺血区组织中黏附分子mRNA水平明显增高,黏附分子大量合成,E选择素与氧自由基之间有着相互影响相互促进的作用关系。在缺血早期阻断P一选择素的表达,减少中性粒细胞在缺血区的聚集和黏附,可以减少卒中后缺血区脑组织神经元的死亡,减小梗死灶体积,改善卒中患者的预后,在多种动物脑缺血模型中,使用抗E-选择素的抗体治疗后,动物存活率增加。NADPH氧化酶与氧自由基的生成和脑组织缺血损伤密切相关,NADPH氧化酶与E选择素之间是否存在相互影响,目前还未见相关研究报道。目的本研究通过建立实验性局灶性脑缺血大鼠模型,即大脑中动脉栓塞模型（MCAO）,观察缺血再灌注脑组织中NADPH氧化酶gp91phox亚单位mRNA和蛋白表达的变化,探讨NADPH氧化酶在缺血再灌注脑组织损伤中的作用；同时,在制作MCAO模型之前,用NADPH氧化酶抑制剂进行预处理,进一步观察缺血再灌注脑组织中MMP-9表达和E-选择素表达的变化,探讨NADPH氧化酶与MMP-9的诱导表达和E-选择素表达之间的相关性,深入了解NADPH氧化酶在缺血再灌注脑组织损伤中的作用及机制,明确NADPH氧化酶是否通过调控MMP-9的表达和E选择素的表达来在缺血再灌注脑组织损伤的病理过程中发挥用,为探索脑组织缺血再灌注损伤新的治疗方法提供新的资料和思路。实验方法（一）建立实验性局灶性脑缺血大鼠模型健康Sprague-Dawley （SD）大鼠54只,雄性,重290-320g,包括对照组、实验组、NADPH氧化酶抑制剂组、溶媒剂对照组。大鼠进行MCAO模型制作后,观察其脑组织中NADPH氧化酶的mRNA水平和蛋白表达、NADPH氧化酶活性、MMP-9表达、E-选择素表达和免疫组化染色等检测。大鼠在外科操作过程中以含异氟醚的NO₂：O₂（70%：30%）混合气体进行麻醉（外科手术诱导时的异氟醚浓度为4%,维持麻醉时的异氟醚浓度为1.75%）。大鼠在整个缺血前、缺血期、再灌注期间都处于麻醉状态。大脑中动脉栓塞模型（MCAO）按1986年Koizumi J创立的腔内线栓模型。缺血再灌注时间设计为90分钟缺血再灌注22.5小时。（二）.脑切片的TTC染色TTC （2,3,5-Triphenyl-2 H-tetrazolium chloride,2,3,5—氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感复合物,最初用来检测种子的生存能力,1958年开始用来染色检测哺乳动物组织的缺血梗塞。它是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体,与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色,因缺血组织内脱氢酶活性下降,不能反应,故不会产生变化而呈苍白色。将2g 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶于100ml磷酸缓冲液中,避光,临用前配制。大鼠脑作冠状切片切成1mm厚的切片,通过2,3,5-氯化三苯基四唑（TTC）染色证实大鼠MCAO模型制作成功。（三）.缺血后的组织处理再灌注结束后大鼠被断头处死,以2%的戊巴比妥钠过度麻醉,被断头处死取脑,取脑后收集非缺血侧和缺血侧半球的脑组织,用来分析gp91phox的蛋白水平（?）mRNA表达、NADPH氧化酶的活性、MMP-9蛋白表达,或石蜡包埋,切片,进行E-选择素免疫组化染色。在快速取脑后放入冰PBS液中冷却5分钟。将离额叶前端3mm处往后8mm范围的脑组织区域进行冠状切片,切成四张2mm厚的切片,将2mm厚的切片仔细去除脑膜,在离两半球间中线2mm处纵向切除主要由大脑前动脉供血的脑组织。然后从每个脑切片中收集非缺血侧和缺血侧半球的脑组织,用来分析gp91phox的蛋白水平和mRNA表达,NADPH氧化酶的活性,以及MMP-9的蛋白表达等。需进行免疫组化染色检测的脑组织标本,在大鼠脑缺血再灌注结束后灌注固定取脑,置于4℃冰箱约5分钟,冻至质稍硬后,立即取右侧大脑自视交叉平面向后冠状切开制成5mm厚的组织块,切其中2mm厚组织,用4%多聚甲醛后固定24h,常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋制成石蜡切块,连续冠状切片,片厚4um,进行E-选择素免疫组化染色。（四） SYBER（?） Green gp91phoxmRNA的定量PCR分析按上述方法收集的脑组织置于玻璃匀浆器中,按100g：3ml的比例加入Trizol试剂进行匀浆处理。然后根据DNA-Free试剂盒技术手册的方法来分离和纯化总RNA。严格按照Trizol RNA提取试剂盒说明书的流程进行,之后进行逆转录反应,具体方法按照TaqMan（?）逆转录试剂盒说明书进行。再以7900HT快速Real-time PCR系统对l逆转录产物进行放大扩增,检测（?）mRNA表达水平。（五）gp9lphox的蛋白印迹分析取缺血半球和非缺血半球脑组织加入含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液进行匀浆。离心取上清,10%SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶电泳,转移到硝化纤维膜上,加入单克隆抗gp91phox一抗孵育,加入抗鼠的HRP结合抗体孵育,随后,用SuperSignal West Pico化学发光试剂盒使纤维膜显影以检测蛋白,具体步骤按操作说明书进行,用Kodak图像工作站4000数字显影系统对条带进行显影观察和定量计算。（六）.NADPH氧化酶活性测定采用过氧化物诱导的光泽精光电效应法测定NADPH氧化酶的酶活性。先将脑组织匀浆,加入含光泽精的Krebs缓冲液和匀浆液,加入底物NADPH溶液,加入NADPH之后,酶对底物的消化反开始进行。将小管放入TD-20/20光度计中,通过对每个样本的NADPH氧化酶活性进行分析。光度计则每30秒记录一次化学发光量,连续记录5分钟,以每分钟每mg蛋白的相对发光单元（RLU/min/mg）来表示化学发光量。（七）.MMP-9明胶酶谱分析将缺血半球和非缺血半球脑组织进行匀浆。测定匀浆液的蛋白浓度。MMP-9分析采用明胶酶谱法,在非还原条件下以含lmg/m1明胶的10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。Triton X-100（?）（?）凝胶漂洗,然后37℃下在显影缓冲液中孵育72小时,随后染色,脱色,直到明胶分解带清楚地显示在深蓝的背景上。明胶分解条带的强度以Kodak 4000图像工作站进行分析。（八）E-选择素的免疫组化染色脑组织石蜡切片脱蜡、水化后,抗原修复,阻断内源性过氧化物酶,加入兔单克隆抗鼠E-selectin抗体,孵育加生物素标记的羊抗鼠lgG,孵育,以PBS加抗生物素蛋白—过氧化酶溶液,加入新鲜配制的AEC溶液,显微镜下观察,阳性显色为棕色或褐色。苏木素复染,中性树胶封固。结果一.TTC染色证实MACO型制作成功：TTC染色是证实MCAO成功的最简便方法之一。实验可见,将lmm厚的脑组织切片进行TTC染色,显示90分钟MACO和22.5小时再灌在缺血半球产生大面积脑梗死,可见右侧半球大脑中动脉供血区有明显的梗死灶形成,梗死范围主要累及皮质、皮质下白质、纹状体区域等,表明MCAO模型制作成功。二.缺血再灌注脑组织中NADPH氧化酶亚单位gp91phoxmRNA上调和蛋白表达增加定量RT-PCR显示,于对照组和非缺血侧相比,实验组缺血再灌注脑组织中,NADPH氧化酶亚单位gp91phox mRNA表达显著增加。在实验组的大鼠,缺血侧脑组织比非缺血侧脑组织中的NADPH氧化酶亚单位gp91phoxmRNA的表达明显上调。Western blot分析显示在非缺血半球脑组织gp91phox蛋白为低水平表达,但在MCAO大鼠缺血侧半球脑组织中gp91phox蛋白表达水平显著升高。三.缺血再灌注脑组织中NADPH氧化酶活性的变化实验采用光泽精增强化学发光法来检测NADPH氧化酶的活性,结果显示,与gp91phox蛋白表达相一致,实验组缺血半球脑组织中NADPH氧化酶活性比非缺血侧半球脑组织及对照组都要显增高。四. NADPH氧化酶抑制剂抑制缺血再灌脑组织gp91phox蛋白上调和酶活性Western blot分析显示,在溶媒对照组处理的大鼠,缺血半球脑组织比非缺血半球组织, gp91phox蛋白的水平显著增加（P<0.05）,表明缺血再灌注显著增加缺血半球脑组织gp91phox蛋白表达。同时,与溶媒对照组相比,NADPH氧化酶抑制剂组的缺血半球脑组织中gp91phox蛋白表达的水平明显减少,表明NADPH氧化酶抑制剂能显著抑制缺血半球脑组织中gp91phox蛋白的表达,但两组之间非缺血半球脑组织中gp91phox蛋白的表达无明显改变,表明NADPH氧化酶抑制剂能抑制缺血脑组织中gp91phox蛋白的表达（P<0.05）。同时,NADPH氧化酶抑制剂组缺血侧脑组织中NADPH氧化酶活性比溶媒对照剂组缺血侧脑组织中NADPH氧化酶活性明显降低,表明NADPH氧化酶抑制剂能抑制缺血再灌注脑组织的NADPH氧化酶gp91phox蛋白的表达以及酶的活性,五. NADPH氧化酶抑制剂抑制缺血再灌脑组织中MMP-9的表达结果显示,两组缺血半球脑组织中MMP-9蛋白的表达均比非缺血半球脑组织中MMP-9蛋白表达水平要显著增加（P<0.05）,表明缺血再灌注显著诱导脑组织MMP-9的蛋白表达。另一方面,与溶媒对照组缺血半球脑组织相比,NADPH氧化酶抑制剂组缺血半球脑组织中MMP-9表达的增加被明显抑制（P<0.05）,表明NADPH氧化酶抑制剂在抑制NADPH氧化酶的表达和酶活性的同时也抑制缺血再灌注脑组织中MMP-9的表达。六. NADPH氧化酶抑制剂抑制缺血再灌脑组织gp91phox蛋白和E-选择素的表达Western blot分析显示,溶媒对照组处理的大鼠,缺血再灌注后脑组织gp91phox蛋白的表达水平显著增加,E-选择素蛋白的表达水平也显著增加,在NADPH氧化酶抑制剂组,缺血半球脑组织中gp91phox蛋白表达的水平和E-选择素蛋白表达水平相应地明显减少,同时,免疫组化染色结果显示,在缺血再灌注组的大鼠,海马CA1区和缺血脑皮质中E-选择素阳性细胞显著增多,在NADPH氧化酶抑制剂预处理后,这些区域脑组织中E-选择素阳性细胞数明显减少,结果表明缺血再灌注脑组织NADPH氧化酶的表达与E-选择素蛋白表达之间有相关性,NADPH氧化酶通过某种途径介导了E-选择素的表达调控。结论1.缺血再灌注脑组织中NADPH氧化酶催化亚单位gp91phox mRNA水平和蛋白表达明显上调,NADPH氧化酶活性显著增高。2.NADPH氧化酶抑制剂能抑制缺血脑组织中NADPH氧化酶gp91phox的表达和MMP-9的诱导表达,缺血再灌注脑组织中的MMP-9表达与NADPH氧化酶亚单位gp91phox存在相关性,gp91phox是缺血脑组织中MMP-9诱导表达的一个主要促发因素。3.在缺血再灌注脑组织中,E-选择素的表达上调,缺血脑组织皮质和海马CA1区E-选择素阳性细胞数目明显增多,NADPH氧化酶被抑制后,E-选择素的表达下调,缺血脑皮质和海马CA1区E-选择素阳性细胞数目明显减少,表明缺血再灌注后NADPH氧化酶通过某种途径介导了E-选择素的表达调控。