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目的:阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)是一种复杂的中枢神经系统退行性疾病,其典型病理特征为由β-淀粉样蛋白(Amyloid-βpeptide,Aβ)沉积引起的胞外老年斑(Senile plaques,SPs)和Tau蛋白过度磷酸化形成的胞内神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)。在AD的多种发病机制假说中,Aβ假说主张Aβ过度产生和/或清除障碍造成的Aβ胞外沉积可能是其主要致病因素,其中针对Aβ42聚集行为的影响因素研究是当前的热点问题。分泌型Clusterin(sCLU)蛋白作为Aβ的胞外分子伴侣,在Aβ寡聚体的形成过程中起着至关重要的作用,但目前的研究报道却存在着矛盾的结果和观点。因此,本论文旨在单分子水平探讨sCLU对Aβ42聚集的影响,以期获得二者间相互作用的分子机制,为揭示AD的发病机制提供实验基础。 方法:(1)sCLU-His蛋白的构建、表达和纯化。构建pFastBac1-sCLU-His质粒,选用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统真核表达sCLU-His蛋白,之后采用镍柱(Ni-NTA)和凝胶过滤(Gel filtration,GF)两步柱层析法进行纯化并进行SDS-PAGE、Western blotting、HPLC等方法的分析鉴定。(2)不同荧光标签对Aβ42聚集行为的影响。分别将6种不同的N-羟基琥珀酰亚胺基酯和异硫氰酸酯类荧光染料BODIPY(@)FL-C5(BP)、N-hydroxysuccinimide rhodamine B ester(RB)、Rhodamine B isothiocyanate(RITC)、6-(fluorescein-5-carboxamido)hexanoic acid succinimidyl ester(5-SFX)、Fluorescein5(6)-isothiocyanate(5(6)-FITC)和Alexa Fluor647(Alexa)标记Aβ42单体后,制备成Aβ42/BP、Aβ42/RB、Aβ42/RITC、Aβ42/5-SFX、Aβ42/5(6)-FITC以及Aβ42/Alexa荧光标记单体,然后采用荧光关联光谱(Fluorescence correlation spectroscopy,FCS)考察不同荧光标签对Aβ42聚集行为的影响。(3)sCLU-His对Aβ42聚集行为影响的动力学性质变化。选取前期工作中制备的Aβ42/Atto及上述的Aβ42/RB、Aβ42/5(6)-FITC和Aβ42/Alexa分别组合为易聚(Aβ42/Atto~Aβ42/RB)和难聚(Aβ42/5(6)-FITC~Aβ42/Alexa)的Aβ42/Label模型,应用荧光能量共振转移-荧光交叉相关光谱(Fluorescence resonance energy transfer-Fluorescence correlation spectroscopy,FRET-FCS)技术分别考察不同浓度的sCLU-His(0.1、1和10μM)对1μM的两组Aβ42/Label聚集模型影响的动力学性质变化。 结果:(1)成功构建表达了sCLU-His蛋白,经HPLC测定,分子量为67.3kD,纯度达96.8%,可满足后续实验要求;(2)经FCS实验测定,发现不同荧光标签对Aβ42聚集行为的影响不同,其中Aβ42/BP、Aβ42/RB和Aβ42/RITC显示出不同程度的聚集状态,而Aβ42/5-SFX、Aβ42/5(6)-FITC和Aβ42/Alexa则基本不聚集,因此,对不同荧光标记Aβ42/Label的不同聚集行为的分子机制进行了探讨;(3)FRET-FCS实验结果显示,除0.1μM外,1和10μM的sCLU-His加入后均可检测到大的复合体产生,但在Aβ42/Atto~Aβ42/RB组中复合体的荧光强度却降低,说明sCLU-His与两组Aβ42/Label均可形成复合体,sCLU-His对Aβ42/Atto~Aβ42/RB的自聚有抑制作用,且抑制机制符合“草莓模型”假说。 结论:1.成功构建表达并纯化了满足实验要求的sCLU-His蛋白;2.不同荧光标签对Aβ42聚集行为的影响不同,使得其更易或不易聚集;3.sCLU-His抑制Aβ42/Label聚集的分子机制符合“草莓模型”假说。