论文部分内容阅读
研究背景:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是全球第三大常见的恶性肿瘤,也是全球导致肿瘤相关死亡的第二大原因,据估计全世界每年有551,269人死于CRC。复杂的微生物群落栖息于人体肠道,其中包含1014多种微生物。这些微生物的基因数量是人类基因组的150倍以上,也被称为人体的第二个基因组。近年来,结直肠癌相关肠道微生态研究受到国内外研究者的广泛关注。多项研究支持人类肠道微生态在CRC癌变中起着至关重要的作用。益生菌的应用正成为CRC的一种可能有效的治疗和预防策略。其中双歧杆菌为革兰阳性厌氧杆菌,是肠道中重要的生理菌属,在维持宿主健康中起重要作用。然而,目前为止仍然缺乏基于高通量测序、多组学分析、系统生物学方法对CRC宿主与肠道菌群相互作用的全面研究。基于以上背景,本论文计划研究CRC癌变及益生菌干预下肠道微生态结构及功能对宿主功能基因表达的关联。研究方法:本研究共分为两部分,第一部分主要探索肠道微生物参与结直肠癌变的可能机制,从CRC患者中收集了匹配癌与癌旁肠黏膜组织样本,然后检测肠黏膜组织中多种宿主及微生物组学包括肠黏膜微生物组学,肠黏膜代谢组学,宿主转录组学和宿主表观组学,综合分析结直肠癌患者癌与癌旁肠黏膜组织菌群结构、代谢物组成及宿主DNA甲基化和功能基因表达的关联。第二部分主要探索肠道微生态相关结直肠癌防治策略,研究从健康人群粪便中分离的益生菌两歧双歧杆菌的灌胃对AOM/DSS诱导C57BL/6小鼠结直肠癌变的影响,综合分析小鼠粪便菌群结构、代谢物组成及小鼠肠道功能基因表达的关联。研究结果:第一部分:1.本研究发现共15种微生物分类群在CRC癌与癌旁肠黏膜组织之间存在显著差异。其中嗜盐杆菌科（Halomonadaceae）,嗜盐单胞菌属（Halomonas）,希瓦氏菌属（Shewanella）,梭杆菌属（Fusobacterium）,费氏杆菌（Fretibacterium）,消化链球菌属（Peptostreptococcus）和克雷伯菌属（Klebsiella）在癌肠黏膜组织中相对丰度显著升高（p值<0.05）,而Paeniclostridium,拟杆菌属（Bacteroides eggerthii）,乳杆菌属（Lactobacillus）,普雷沃菌属（Prevotella 2）,肠球菌属（Enterococcus）,产气荚膜梭菌属（Clostridium perfringens）和韦永氏菌属（Veillonella）在癌肠黏膜组织中相对丰度显著降低（p值<0.05）。2.本研究共发现8种癌与癌旁肠黏膜组织之间显著差异代谢物,其中与癌旁肠黏膜组织相比4-羟基丁酸（4-hydroxybutyrate acid,4-HB）,lyxose,草酸（oxalic acid）,D-塔洛糖（D-talose）在癌肠黏膜组织中水平降低,而乳酸（lactic acid）,谷氨酸（glutamic acid）,牛磺酸（taurine）,十四烷（tetracosane）在癌肠黏膜组织中水平升高。3.本部分研究共发现16个DNA甲基化相关的差异表达基因,其中EPHB1,FREM2,GAD1,GRIN2D,PLCB1在癌肠黏膜组织中高表达（基因启动子区域低甲基化）,FCRLA,FOLR2,GNG2,GPNMB,CHP2,IGSF9,LSP1,MT1M,PI16,RELN和SCG2在癌肠黏膜组织中低表达（基因启动子区域高甲基化）。4.本研究发现与癌旁肠黏膜组织相比,癌肠黏膜组织中微生物分类群,丁酸相关的代谢物和甲基化相关的宿主差异表达基因之间存在显著相关性。梭杆菌属（Fusobacterium）的相对丰度升高与4-羟基丁酸（4-HB）的水平降低以及免疫相关肽酶抑制剂16（peptidase inhibitor 16,PI16）,Fc受体样A（Fc Receptor Like A,FCRLA）和淋巴细胞特异性蛋白1（Lymphocyte Specific Protein 1,LSP1）表达的下调显著相关。本研究还发现与4-HB相关的普氏杆菌属（Prevotella 2）的相对丰度降低与金属硫蛋白1M（metallothionein 1M,MT1M）的表达下调呈显著负相关。此外,与谷氨酸（glutamic acid）相关嗜盐杆菌科（Halomonadaceae）相对丰度的增加与reelin（RELN）表达的降低呈显著正相关。Paeniclostridium属和肠球菌属（Enterococcus）的相对丰度降低与乳酸水平升高呈显著负相关,并且分别与磷脂酶C Beta 1（Phospholipase C Beta 1,PLCB1）和免疫球蛋白超家族成员9（Immunoglobulin Superfamily Member 9,IGSF9）的表达变化显著相关。4-HB,谷氨酸和乳酸都是丁酸前体,其可通过表观遗传调控（包括DNA甲基化）改变基因表达。第二部分:1.与健康小鼠（PBS组）相比,小鼠结直肠癌模型组（AOM组）粪便中拟杆菌（Bacteroidetes）,毛螺旋菌属（Parasutterella）,Coriobacteriaceae,放线菌门（Actinobacteria）,消化球菌科（Peptococcaceae）,梭菌科（Clostridiaceae）,Ruminiclostridium9和链球菌科（Streptococcaceae）的相对丰度有所增加。2.与AOM组相比,两歧双歧杆菌灌胃（AOM.BF组）可减轻结直肠癌小鼠模型中肠道癌变情况、改善AOM/DSS诱导的肠道菌群紊乱。该组小鼠粪便中阿克曼氏菌（Akkermansia）,脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）,Romboutsia,Turicibacter,疣微菌科（Verrucomicrobiaceae）,RuminococcaceaeUCG013,LachnospiraceaeUCG004和乳杆菌（Lactobacillus）相对丰度增加。3.与AOM组相比,两歧双歧杆菌灌胃可调节小鼠粪便中涉及逆行内源性大麻素信号传导（Retrograde endocannabinoid signaling）,ABC转运蛋白（ABC transporters）,鞘脂代谢（Sphingolipid metabolism）,糖酵解/糖异（Glycolysis/Gluconeogenesis）,谷胱甘肽代谢（Glutathione metabolism）,糖脂代谢（Glycerolipid metabolism）,半乳糖代谢（Galactose metabolism）,蛋白质消化吸收（Protein digestion and absorption）,甘油磷脂代谢（Glycerophospholipid metabolism）,膦酸酯和次膦酸酯代谢（Phosphonate and phosphinate metabolism）等代谢途径的代谢物浓度。4.各组小鼠肠组织转录组差异分析AOM组与PBS组、AOM组与AOM.BF组间对比中共同显著差异表达的基因主要参与Toll样受体4信号转导通路的调控（regulation of toll-like receptor 4 signaling pathway）、抗菌肽介导的抗菌体液免疫反应（antimicrobial humoral immune response mediated by antimicrobial peptide）、表皮细胞分化（epidermal cell differentiation）、上皮细胞增殖的调节（regulation of epithelial cell proliferation）等基因通路。5.本研究还发现AOM组与AOM.BF组间差异微生物、差异代谢物,差异表达基因之间存在显著相关性。Romboutsia的相对丰度与乳酸（lactic acid）水平呈负相关,与柠檬酸（citric acid）水平呈正相关。此外,本部分研究还发现微生物分类群Turicibacter,LachnospiraceaeUCG004也与柠檬酸浓度呈正相关。而Ruminiclostridium9的相对丰度与柠檬酸水平呈负相关。另外,消化球菌科（Peptococcaceae）和Ruminiclostridium9的相对丰度与1,5-戊二胺（cadaverine）水平呈负相关。差异表达基因与至少一个差异微生物或差异代谢物显著相关。结论:1.本研究发现了CRC患者的配对癌与癌旁肠黏膜组织中,与CRC相关的微生物分类群,丁酸相关代谢物和DNA甲基化相关差异表达基因之间的关联。这揭示了肠道微生物作用于CRC的可能机制,即肠道菌群失衡可能通过影响重要代谢物水平而影响功能基因表达,此过程长期积累可能导致肠黏膜组织癌变。此外,这些发现为CRC的诊断提供了可能的生物标志物,为CRC的治疗和/或预防策略提供了理论依据。2.本研究支持健康人粪便分离的益生菌两歧双歧杆菌在肠道健康中的保护作用,可能通过改善肠道菌群失调进而调节肠道代谢状况,改变宿主功能基因表达来影响结直肠癌变过程。使用益生菌调节肠道菌群可能成为CRC的有效预防策略。