【摘 要】
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血管紧张素转换酶（Angiotensin I-converting enzyme,ACE,E.C 3.4.15.1）具有催化血管紧张素II（具有升高血压的作用）的形成和降解缓激肽（具有降血压的作用）的作用。可以通过抑制ACE活性治疗高血压。绵羊乳具有极高的营养价值且酪蛋白含量高是制备ACE抑制肽的良好来源。因此,本研究旨在利用蛋白酶水解绵羊乳酪蛋白,制备新型ACE抑制肽并对其分子抑制机制进行分析。
【基金项目】
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西北农林科技大学金昌奶绵羊试验示范基地建设项目（编号:A289021806）；
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血管紧张素转换酶（Angiotensin I-converting enzyme,ACE,E.C 3.4.15.1）具有催化血管紧张素II（具有升高血压的作用）的形成和降解缓激肽（具有降血压的作用）的作用。可以通过抑制ACE活性治疗高血压。绵羊乳具有极高的营养价值且酪蛋白含量高是制备ACE抑制肽的良好来源。因此,本研究旨在利用蛋白酶水解绵羊乳酪蛋白,制备新型ACE抑制肽并对其分子抑制机制进行分析。试验选用五种蛋白酶水解绵羊乳酪蛋白,以水解度（Degree of hydrolysis,DH）、分子量分布和ACE抑制率为指标筛选最佳水解蛋白酶,接着使用单因素和响应面试验进行工艺优化,然后利用Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS对小于3 k Da组分进行氨基酸序列鉴定,筛选潜在的ACE抑制肽进行人工合成并测定其半抑制浓度(IC50),采用Linewaver-Burk作图确定酶抑制动力学,结合分子对接进一步解释肽段的抑制机制,为功能性绵羊乳多肽乳制品开发提供技术支持。结果表明:（1）五种蛋白酶对绵羊乳酪蛋白水解能力依次为:碱性蛋白酶（J）>胰蛋白酶（Y）≥蛋白酶K（K）>中性蛋白酶（Z）>胃蛋白酶（W）;五种蛋白酶的绵羊乳酪蛋白水解液最大ACE抑制率排序为:J（94.25%）>K（92.61%）>Z（90.16%）>W（88.22%）>Y（85.54%）。（2）碱性蛋白酶水解绵羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的最佳工艺条件为:p H 6、底物浓度8%、酶添加量（E/S）4%、温度55℃、水解时间90 min,酪蛋白水解液ACE制率为99.1%;绵羊乳酪蛋白水解液中分子量在0.2-1 k Da的肽段比例最大,其次为1-3 k Da的肽段。（3）从小于3 k Da酪蛋白水解液中共鉴定出411条肽段,源自αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白分别为84、116、137和74,发现已经验证具有ACE抑制活性的肽段18条,分子量在1-1.5 k Da肽段比例为33.82%;在0.5-1 k Da肽段比例为24.57%;在1.5-2k Da肽段比例为20.44%;在2-3 k Da的肽段比例为18.9%。（4）筛选出8条新颖的ACE降血压肽:FYPQLFR和LFRQFY源自αs1-酪蛋白,IC50值分别为13.95μM和7.91μM,对ACE抑制都为混合型抑制模式;分子对接表明,FYPQLFR与ACE的S1活性口袋中的Glu384和Tyr523残基分别形成一个氢键,与Ala354残基形成两个氢键,与S2活性口袋中His513残基成一个氢键,同时与Zn2+形成四面体结构中的ACE氨基酸残基His387、Glu411和ZN701分别形成一个氢键和2个静电力,LFRQFY能够与ACE的氨基酸残基Ala354（活性口袋S1）、His353（活性口袋S2）形成氢键相互作用,而展现出显著的体外降血压活性。YQKFPQ和KFPQYL源自αs2-酪蛋白,IC50值分别为64.57μM和43.98μM,对ACE分别为混合型抑制模式和竞争性抑制模式;分子对接表明,YQKFPQ与ACE残基共形成13个氢键,KFPQYL与ACE的S1活性口袋中Glu384残基形成一个氢键,同时与Zn2+形成四面体结构中的残基Glu411形成一个静电力,这两个作用力会抑制ACE催化活性,使KFPQYL具有降血压作用。YYQQRP、FLPYPY和KYIPIQY源自κ-酪蛋白,IC50值分别为7.96μM、148.55μM和5.73μM,对ACE都为混合型抑制模式;分子对接表明,YYQQKP与ACE的S1活性口袋残基Ala354和Tyr523分别形成一个氢键和一个疏水作用力,与S2活性口袋残基Lys511、Tyr520、His353和His513形成6氢键和一个静电力,与ZN701形成一个金属配体（Metal-Acceptor）相互作用并与His383形成一个疏水作用力,FLPYPY与ZN701形成一个静电作用力和与Met223形成π-烷基相互作用,KYIPIQY与ACE的S1和S2活性口袋中的Ala354和His353形成2个氢键和3个疏水作用力,与ACE残基His383、His387和Glu411之间形成3个氢键和一个疏水作用力可能会导致四面体配位的Zn2+的扭曲进而造成ACE催化活性的失活。RGPFPIL源自β-酪蛋白,IC50值为8.15μM,对ACE为混合型抑制模式;分子对接表明,RGPFPIL和与Zn2+形成四面体结构中的ACE氨基酸残基His387形成一个疏水作用力。
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