【摘 要】
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目的:探讨FW-04-806（FW）对人肝癌细胞凋亡及自噬的影响和分子机制,并研究FW与化疗药物sorafenib（Sora）联用的体内外抗肝癌作用。方法:MTT法检测FW对肝癌细胞增殖抑制作用;Annexin V/PI双染法检测细胞的凋亡率;免疫印迹法检测细胞凋亡、自噬及IL-6/Jak2/Stat3通路相关信号分子的蛋白表达水平;慢病毒转染法构建EGFP-LC3及RFP-EGFP-LC3稳转肝
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目的:探讨FW-04-806（FW）对人肝癌细胞凋亡及自噬的影响和分子机制,并研究FW与化疗药物sorafenib（Sora）联用的体内外抗肝癌作用。方法:MTT法检测FW对肝癌细胞增殖抑制作用;Annexin V/PI双染法检测细胞的凋亡率;免疫印迹法检测细胞凋亡、自噬及IL-6/Jak2/Stat3通路相关信号分子的蛋白表达水平;慢病毒转染法构建EGFP-LC3及RFP-EGFP-LC3稳转肝癌细胞株,激光共聚焦显微镜观察FW对肝癌细胞LC3自噬斑点及自噬流的影响;免疫荧光法检测肝癌细胞内p-Stat3的表达水平和分布情况;免疫共沉淀法检测FW对Jak2和Stat3蛋白相互作用的影响;质粒转染法敲低及回复Stat3基因,探讨Stat3对于肝癌细胞凋亡和自噬的影响;建立QGY7703细胞裸鼠皮下移植瘤模型,探讨FW体内抗肿瘤作用;免疫印迹法检测瘤组织中自噬、凋亡及Stat3通路相关蛋白的表达;免疫组织化学法检测瘤组织中Stat3和p-Stat3表达水平;MTT检测FW与Sora联合对QGY7703、Hep G2细胞增殖抑制作用的协同效果,用Compu Syn软件分析协同指数（CI值）;建立QGY7703细胞裸鼠皮下移植瘤模型,探讨FW联合Sora体内抗肝癌作用。结果:FW作用48h后抑制人肝癌细胞QGY7703、SMMC-7721、SK-Hep1、Hep G2、Hep3B和Hu H7的增殖,其中对QGY7703和Hep G2细胞增殖抑制作用显著,且呈时间-剂量依赖性。FW作用后,QGY7703、Hep G2细胞的凋亡率显著增高,并伴随着抗凋亡蛋白Bcl-2、PARP、Caspase-3/7/9下调,促凋亡蛋白Bax、Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3/7/9上调,而且凋亡抑制剂Z-VAD-FMK能够部分逆转其诱导的凋亡作用。FW作用后,肝癌细胞中自噬相关蛋白LC3和P62的表达显著上调,LC3自噬斑数量增加,自噬流通量减少。FW抑制Stat3内源性及外源IL-6诱导性激活,下调IL-6/Jak2/Stat3通路相关蛋白Jak2、c-myc、Cyclin D1的表达。免疫共沉淀结果表明,FW减少Jak2蛋白与Stat3蛋白的结合。敲低肝癌细胞Stat3基因后,FW诱导细胞凋亡、抑制自噬作用增强;Stat3过表达回复后,FW对肝癌细胞凋亡、自噬产生的效应随之回复。12.5、25μmol/L FW联合不同浓度Sora作用48h后,对QGY7703、Hep G2细胞平均CI值分别为0.80±0.14、0.90±0.12,其中25μmol/L FW联合10μmol/L Sora的CI值最小;FW联合Sora协同诱导肝癌细胞凋亡;两者协同抑制p-Stat3、Caspase-3蛋白表达,促进Cleaved Caspase-3、LC3蛋白表达,FW减少Sora引起的P62蛋白降解。体内研究表明,FW显著抑制QGY7703细胞裸鼠移植瘤的生长,而且FW与Sora可协同抑制移植瘤生长。结论:FW对人肝癌细胞有较好的体内外抗肿瘤活性。FW诱导QGY7703、Hep G2细胞Caspase途径介导的凋亡,抑制肝癌细胞晚期自噬,其作用机制可能与FW抑制Stat3持续性或诱导性激活有关。此外,FW抑制Sora诱导的自噬,提高肝癌细胞凋亡率,增强Sora体内外抗肝癌作用。
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