论文部分内容阅读
EAP1是一种转录调节因子,最初是由Sabine Heger等在对雌性猴子下丘脑发育研究中被发现,由于它的表达量在青春期时持续增加,将其命名为enhanced at puberty 1,即EAP1。在非人灵长类动物和啮齿类动物下丘脑中,EAP1在青春期的表达都有选择性地增加。通过慢病毒介导的EAP1 siRNA靶向啮齿动物下丘脑抑制EAP1的表达,导致青春期延迟,发情周期性被破坏,卵巢发育异常。因此探究EAP1的功能对于研究哺乳动物青春期和女性生殖周期具有重要的意义。本实验室在前期研究中利用CRISPR-Cas9敲除斑马鱼EAP1基因并得到纯合突变体,初步研究在雄鱼中未发现明显异常的表型。因此本论文集中在雌性斑马鱼青春期及生殖能力的研究。斑马鱼EAP1基因敲除后,发现纯合突变体后代性别比例严重失衡,雌鱼约占16.37%,而在同一时期相同条件饲养的野生型斑马鱼中,雌鱼约占45.53%。通过qPCR检验发现EAP1基因在早期性腺发育过程中表达量稳定,在成熟的精巢和卵巢中也有表达,推测EAP1基因可能参与斑马鱼的性别决定过程。通过选择相同鱼龄的雌雄斑马鱼进行交配,对其第一次产卵时间、产卵数目,死卵数目、6-48hpf胚胎死亡率、卵巢发育、产卵周期等数据进行统计,发现EAP1纯合突变体后代第一次产卵时间延迟:野生型平均为94天,纯合突变体平均为108天;通过石蜡切片及HE染色发现卵巢发育延迟;产卵数目减少:野生型平均为160颗,纯合突变体平均为123颗;0-48h胚胎死亡率高于野生型;产卵周期推迟:野生型产卵周期平均为4.025天,EAP1纯合突变体产卵周期平均为4.775天;EAP1纯合体卵子成熟速度降低。有研究认为EAP1是KISS1(蛋白编码基因,产物为kisspeptins神经元产生的一类多肽类激素,在斑马鱼中KISS基因有KISS1和KISS2两种)和GnRH(促性腺激素释放激素,在斑马鱼中有GnRH2和GnRH3两种)的上游基因。EAP1的表达对KISS 1有抑制作用,同时抑制自身的表达。KISS 1编码的kisspeptins能够促进GnRH的分泌。EAP1、KISS1、GnRH的表达均定位在鱼脑中,EAP1基因敲除后,通过qPCR检验发现KISS1和KISS2的表达量都受到不同程度的抑制,且GnRH2、GnRH3的表达量都降低,这与雌性斑马鱼第一次产卵时间延迟和卵巢发育延迟是一致的。同时EAP1对于卵巢细胞的凋亡也产生影响,通过流式检测卵巢细胞凋亡情况发现纯合突变体的细胞凋亡高于野生型,但是无显著的统计学差异。本研究表明EAP1参与调控斑马鱼的青春期并影响雌性斑马鱼的生殖功能。