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海带(Laminaria japonica)的生活史中存在着明显的大型孢子体和微型配子体的世代交替。在相同的条件下,雌、雄配子体在发育过程中存在着诸多差异。本研究从差异表达基因的筛选和分离出发,探究造成这种差异的遗传背景,并对该基因的功能进行推测和分析。
根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库中筛选出的克隆18序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),获得了一条长2087bp的cDNA序列,其中开放阅读框1275bp,5’-非翻译区(untranslated region,UTR)长118bp,3’-UTR长694bp且具有明显的polyA尾巴。蛋白同源搜索结果显示,它编码的蛋白与Guillardiatheta这种隐藻核型体编码的CbbX蛋白具有66%同源性,因此被称为cbbX基因。海带配子体cbbX基因编码一个含有424个氨基酸的前体蛋白,前19个氨基酸为信号肽序列。酶切后的成熟蛋白由405个氨基酸组成,推测其分子量为45.26kD,等电点为5.28。海带配子体cbbX基因被8个内含子隔离开,这些内含子的剪切位点都遵循“GT-AG”规则。无论在cDNA或者DNA序列上,雌、雄配子体cbbX基因都没有任何差异。在编码蛋白的第184位Gly开始,具有一个典型的WalkerATP-结合motif。通过与其它物种共14个CbbX蛋白序列构建的neighbor-joining系统演化树可知,它与隐藻核型体以及红藻核编码的蛋白聚成一类,而区别于叶绿体编码的蛋白。因此,推测该克隆的海带配子体cbbX基因可能是由核基因组编码的。
根据配子体cbbX基因cDNA全长序列设计引物,运用实时荧光定量PCR(quantitative real-timePCR,Q-RT-PCR)技术,研究雌、雄配子体cbbX基因在正常光周期的日表达情况,结果表明该基因在雌、雄配子体中的转录确实存在着差异性,光对cbbX基因的转录具有上调的诱导作用。当将配子体转入全光照情况下,发现雌、雄配子体cbbX与编码RuBisCo(ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase)大亚基rbcL基因在上午12点及夜晚4点、雄配子体在晚上8点都存在一个转录峰值,说明cbbX基因的转录还存在着内源节律性。当加入NaHCO3后,雌、雄配子体cbbX及rbcL基因的Q-RT-PCR结果表明,雌配子体cbbX基因的转录比rbcL基因慢4h达到最高点,而雄配子体中两基因同步转录,表明cbbX基因与rbcL基因所编码的蛋白可能一起参与卡尔文循环的碳同化过程;CO2对cbbX基因以及rbcL基因的转录都具有上调的诱导作用。推测cbbX基因与rbcL基因的同步转录,不仅有利于配子在释放前通过光合作用的暗反应累积物质与能量,而且提供一个低CO2的水环境以便成熟配子的释放,从而完成受精过程。