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猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的猪的一种传染性呼吸道疾病，给世界养猪业造成了严重的经济损失。预防和控制该病的主要措施是疫苗免疫接种。目前商品化的灭活菌苗和亚单位疫苗能够减轻同血清型菌感染猪引起的临床症状并降低死亡率，但不能对相异血清型菌的感染提供完全的交叉保护。可以说，目前采用灭活苗和亚单位疫苗免疫不是最好的选择，迫切需要更安全、高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。与灭活菌苗和亚单位疫苗不同，自然感染或试验感染能够诱导抗其他异种血清型的保护。弱毒活疫苗也许是解决当前商品化疫苗不足的一种可行方法。
本研究以传染性胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌WF83株为亲本株，用卡那霉素抗性基因作为抗性筛选基因置换缺失完整的apxⅡC基因，同时引入血清1型Shope4074菌株apxⅠN基因及相对应的分泌基因apxⅠAC，使构建的突变株产生的ApxⅡ因不能被apxⅡC基因编码的蛋白ApxⅡC乙酰基化而失去原有的溶血活性和细胞毒性，实现了ApxⅡ的减毒，同时又引入apxⅠ毒素，期望该毒素能够诱发免疫反应，产生针对两种不同血清型的保护，并对该减毒株的生物学特性进行了初步研究。
1、重组转移载体pBSNKAR的构建
根据Prideaux等的引物和传染性胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌L25-4株的apxⅡ操纵子的部分序列设计并合成了两对引物，从APP-7 WF83株PCR扩增apxⅡC基因上游2，200 bp左右的片段作为左同源臂，将该片段与pBS-T载体连接，命名为pBSL；PCR扩增apxⅡC基因下游1，400b左右的片段作为右同源臂，将该片段与pMD19-T Simple载体连接，得到克隆质粒pMD19-RLN。根据pEGFP-N1序列合成了一对引物，扩增826 bp的卡那霉素抗性基因，将该片段与pMD19-T Simple载体连接，得到克隆质粒，命名为pMD19-Kanlinker。根据APP-1Shope4074株的序列设计两对引物，从APP-1扩增1243bp的apxⅠN基因，将该片段与pBS-T载体连接命名为pBSapxⅠN；扩增377bp的apxⅠAC基因，并将该片段与pBS-T载体连接，；命名为pMD19-apxⅠAC。
pBSL经EcoRⅠ和PstⅠ双酶切后回收大片段，pMD19-apxⅠANS经EcoRⅠ和PstⅠ双酶切后回收小片段。回收的两个片段进行定向连接，进行PCR和单双酶切鉴定，命名为pBSLN。获得的pBSLN经PstⅠ和NotⅠ双酶切后回收大片段，与pMD19-kanlinker经PstⅠ和NotⅠ酶切后回收的小片段kanlinker进行定向连接，进行PCR和单双酶切鉴定，命名为pBSLNK。pBSLNK经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后回收大片段，与pMD19-apxⅠAC经BaHⅠ和NotⅠ双酶切后回收的小片段apxⅠAC进行定向连接，进行PCR和单双酶切鉴定，命名为pBSLNKA。pBSNKA经NotⅠ和SacⅠ双酶切后回收大片段，与pMD19-RLN经NotⅠ和SacⅠ双酶切后回收小片段RLN进行定向连接，进行PCR和单双酶切鉴定，命名为pBSLNKAR，即最终构建的同源重组载体。
2、传染性胸膜肺炎放线杆菌apxⅡC-/apxⅠN+基因缺失减毒株的筛选及鉴定
重组转移载体pBSLNKAR通过电转化导入亲本菌APP-7WF83株，电转化后的产物涂布于TSB/Kan平板，1-2d可获得突变株。将获得的突变株进行卡那霉素抗性试验，证实突变株有卡那霉素抗性；将此突变株进行NAD依赖性试验，证实突变株依赖NAD生长；PCR鉴定证实了卡那霉素抗性基因存在，并证实突变株中含有apxⅠN基因，溶血活性试验证实突变株体外培养丧失溶血活性，将筛选的突变株命名为apxⅡC-/apxⅠN+。apxⅡC-/apxⅠN+突变株小鼠致死实验结果显示突变株未造成小鼠死亡，证实毒力减弱。