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背景:A型肉毒毒素(Botulinum toxin type A,BTX-A)和透明质酸钠(Hyaluronic acid,HA)凝胶联合注射治疗面部年轻化的疗效较单独注射HA凝胶更好,同时发现,BTX-A能明显降低体内HA凝胶的代谢率,具有显著协同作用,但目前国内外并无相关文献报道BTX-A降低HA凝胶代谢的相关机制,另外,在临床操作中,因HA填充剂量过大、填充物移位、血管栓塞、皮肤组织坏死、失明等并发症的发生率较高,需及时注射透明质酸酶(Hyaluronidase,HAase)进行溶解,但目前尚无BTX-A对HAase活性影响的相关文献报道。目的:本实验拟初步研究BTX-A对体外HA凝胶酶降解反应的影响,并在大鼠体内观察BTX-A对HA凝胶代谢的影响,进而探讨二者联合治疗协同作用的发生机制,为临床操作提供实验依据。方法:1、BTX-A对体外HA凝胶酶解反应的影响取海薇和润百颜HA凝胶各5份,每份0.05m L,经2%甲苯胺蓝染色12h,室温(25℃)复温1h后,分别加入BTX-A 2.5U(2.5U/m L)、5.0U(5.0U/m L)、10.0U(10.0U/m L)、20.0U(20.0U/m L)及生理盐水1.0m L,再加入300.0U HAase,于显微镜下观察HA凝胶的酶解状态,记录达最大酶解状态的时间,在0-110min,每间隔10min由显微镜成像系统采集图片,经Image J软件计算平均光密度值(OD)。2、BTX-A对大鼠体内HA凝胶代谢的影响在大鼠背部两侧皮下各注射润百颜HA凝胶0.25m L,5分钟后于BTX-A组真皮层注射BTX-A 5.0U(5.0U/0.1m L),右侧注射生理盐水0.1m L作为自身对照。分别在3d、7d、14d、30d、60d、90d对注射区域皮肤组织及剩余HA凝胶进行取材。免疫组化法检测皮肤组织中透明质酸酶-1(HYAL-1)和透明质酸酶-2(HYAL-2)的表达,采用黄嘌呤氧化酶法和紫外比色法分别检测组织匀浆中SOD和CAT的活性,采用分光光度法检测MDA的含量,利用排水法测量剩余HA凝胶体积,并计算代谢率。结果:1、BTX-A对体外HA凝胶酶解反应的影响在0U、2.5U、5.0U、10.0U、20.0U BTX-A作用下,润百颜产品分别在60min、70min、80min、100min、100min达到最大酶解状态,酶解率分别为72.149%、68.791%、64.683%、58.599%、58.334%;海薇产品分别在60min、70min、90min、100min、100min达到最大酶解状态,酶解率分别为63.390%、54.999%、44.965%、41.890%、42.067%。在0-10.0U,随着BTX-A剂量的增加,对HAase活性的抑制作用逐渐增强,两种HA凝胶达最大酶解状态的时间延长,酶解速率逐渐减小,呈剂量依赖性;超过10.0U,抑制作用不再增加。2、BTX-A对大鼠体内HA凝胶降解的影响一般情况各动物在实验过程中日常活动、生活习惯无明显改变,无躁动及倦怠等异常表现,进食水正常;实验注射前各组大鼠背部皮肤完整,两侧对称无隆起,注射药物后两侧注射区域局部隆起,触之软,界限清,活动度较小,无红斑、皮肤破溃等改变;BTX-A组隆起第3d、7d、14d与对照组相同,第30d、60d、90d BTX-A组较对照组明显隆起。皮肤组织中HYAL-1、HYAL-2的表达BTX-A注射后第3d,皮肤组织中HYAL-1的OD值从对照组的0.256±0.005下降到0.243±0.003(t=3.911,P=0.008);第7d OD值从对照组的0.254±0.006下降到0.240±0.006(t=2.846,P=0.029);14d及以后,两组组织中HYAL-1的表达无变化(P>0.05)。BTX-A注射后第3d,皮肤组织中HYAL-2的OD值从对照组的0.264±0.010下降到0.238±0.005(t=3.897,P=0.008);第7d OD值从对照组的0.263±0.003下降到0.236±0.003(t=11.179,P<0.001);第14d OD值从对照组的0.258±0.006下降到0.233±0.003(t=6.165,P=0.001);30d及以后,两组组织中HYAL-2的表达无变化(P>0.05)。组织中SOD、CAT活性及MDA含量测定BTX-A注射后皮肤组织中SOD、CAT的活性及MDA的含量均无变化(P>0.05)。剩余HA凝胶体积及代谢率BTX-A组和对照组HA凝胶初始体积分别为447.5±10.9mm3和440.0±14.1mm3(t=0.728,P=0.496),90d后分别下降到305.0±11.2mm3和197.5±10.9mm3(t=11.926,P<0.001),代谢率分别为31.8%和55.1%。BTX-A组代谢在第7d后较对照组即显著减慢(P<0.001)。结论:1、BTX-A在0-10.0U对HA的酶解具有剂量依赖性抑制作用。2、BTX-A降低大鼠体内HYAL-1(3d、7d)和HYAL-2(3d、7d、14d)的表达,显著降低体内HA凝胶的代谢。3、BTX-A联合HA凝胶治疗,先行注射BTX-A,14d后再行注射HA凝胶。当选择同期注射BTX-A,在HA填充注射后14d内需注射HAase溶解时,需酌情加大HAase的剂量。