子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)为女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,居女性全身恶性肿瘤第4位,近年随着人口与环境的变化,子宫内膜癌发病率明显上升,手术合并放疗、化疗仍为其主要治疗方式,激素等药物治疗主要适用于晚期或复发性子宫内膜癌患者。目前国际上对子宫内膜癌的临床研究相对丰富,而其病因学研究相对较少,而随着对子宫内膜癌发生发展分子机制的深入研究,越来越多的分子靶向药物,如表皮生长因子受体拮抗剂EFGFR2、mTOR信号通路抑制剂等已得到初步的临床应用并取得了一定疗效。但探寻更为有效的治疗方式仍然是现今学者们研究的主要方向。LINC01016是被发现的在乳腺癌中与雌激素及雌激素受体相关的LncRNA,国内外鲜有报道。Phillip等人通过单分子测序法检测了在乳腺癌细胞系MCF7和T47D中差异表达的基因,并通过后续的染色质免疫共沉淀、PCR、生存分析等方法发现了与ERα相关且高表达的LINC01016,其表达直接影响乳腺癌临床预后及生存率。众所周知,子宫内膜癌也是一种雌激素相关性肿瘤,课题组前期研究结果证实,LINC01016在子宫内膜癌中呈高表达并发挥一定作用。近年来lncRNA与miRNA相互作用进而影响肿瘤生物学行为的研究层出不穷,LINC01016也可通过调控miRNA而影响肿瘤的生物学行为。我们的前期工作通过miRanda、PITA、RNAhybrid及双荧光素酶报告基因系统初步筛选出与LINC01016呈强烈互作关系且在子宫内膜癌中表达明显下调的miR-302a-3p和miR-3130-3p。miR-302/367基因簇家族由人类染色体4p25编码,包含了9个miRNA:miR-302a、miR-302a*、miR-302b、miR-302b*、miR-302c、miR-302c*、miR-302d、miR-367和miR-367*(*示表达水平低),以多顺反子的形式编码。文献报道,miR-302可以提高肝癌细胞和睾丸母细胞瘤细胞系的化疗敏感性及乳腺癌细胞的放疗敏感性,抑制前列腺癌细胞和宫颈癌细胞的增殖。在子宫内膜癌中,miR-302可抑制癌细胞的致瘤性。而在其他的信号通路的建立、转录水平及下游蛋白表观遗传学的改变上,国内外暂无miR-302a与子宫内膜癌的相关性研究。而miR-3130-3p暂无相关研究。通过TargetScan我们初步证明了hsa-miR-302a-3p、miR-3130-3p与NF-YA的3’-UTR存在结合位点。经检索文献发现核转录因子Nuclear transcription factor Y(NF-Y)是一个与CCAAT一致性位点特异性结合的转录因子。临床已证实在乳腺癌及肺癌中上调NF-Y靶基因与预后不良相关。NFYA的剪切变异体可以通过CCAAT结合区域与决定乙醛脱氢酶ALDH活性的ALDH1A1基因启动区结合,在ALDH升高的子宫内膜癌人群组织中,短NF-YA为优先表达状态,而ALDH的高表达与子宫内膜腺癌的预后不良有直接关系。经数据库检索发现Special AT-rich sequence-binding protein 1(SATB1)的转录起始位点上游1000bp,存在NFYA的潜在结合位点(CCAAT)。同时文献检索发现SATB1是首次在T细胞中被发现在染色体重组中起重要作用的细胞特异性核基质附着蛋白,SATB1能够促进肿瘤的生长和转移,在多种肿瘤中表达并提示预后不良,其中包括子宫内膜癌,其被认为是肿瘤转移的主要基因和独立的预后因素。本研究旨在利用前期结果及原位杂交,染色质免疫共沉淀等现代分子生物学方法证明在子宫内膜癌组织中,LINC01016,miR-302a-3p,miR-3130-3p,NFYA与SATB1的表达水平;利用子宫内膜癌细胞系Ishikawa及RL-95-2阐明LINC01016与miR-302a-3p/mi R-3130-3p、miR-302a-3p/miR-3130-3p与NFYA、NFYA与SATB1的互作关系和互作方式;单独或联合上调或下调组织中的LINC01016,miR-302a-3p/mi R-3130-3p或NFYA后,子宫内膜癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和细胞周期的变化。明确LINC01016-miR-302a-3p/miR-3130-3p-NFYA-SATB1调控轴影响子宫内膜癌的发生发展的具体机制,并为子宫内膜癌的研究其诊治提供新思路和新策略。研究方法:1、Real-time PCR方法检测LINC01016在子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织中的表达水平,并分析其表达与子宫内膜癌临床病理参数的关系;构建LINC01016过表达及敲低的稳转子宫内膜癌Ishikawa及RL-95-2细胞系,并通过Real-time PCR对转染效果加以验证;CCK-8实验分别检测两种细胞中LINC01016高表达及敲低后细胞的增殖能力的变化;EdU实验同样检测对LINC01016表达水平进行干预后Ishikawa及RL-95-2细胞的增殖能力变化;流式细胞周期方法检测对LINC01016表达进行干预后细胞周期的变化;流式细胞凋亡方法检测同法处理后细胞凋亡能力改变;划痕实验检测同法处理后细胞迁移能力改变;Transwell实验检测同法处理后细胞侵袭能力改变。2、利用生物信息学软件mi Randa、PITA、RNAhybrid筛选出与LINC10106互作的miRNA;通过Real-time PCR法检测所筛miRNA在子宫内膜癌组织与正常组织中的表达水平,同时满足条件的miRNA为miR-302a-3p,miR-3130-3p,分析其与临床病理参数的关系;构建miR-302a-3p,miR-3130-3p过表达与敲低的子宫内膜癌Ishikawa及RL-95-2细胞系并通过Real-time PCR对转染效果加以验证;通过CCK-8及EdU检测miR-302a-3p,miR-3130-3p分别过表达及敲低后细胞增殖能力变化;流式细胞周期及凋亡实验检测同法处理细胞周期及凋亡情况;划痕实验检测同法处理细胞迁移能力改变;Transwell实验检测同法处理后细胞侵袭能力改变;在对LINC01016进行干预后,Real-time PCR法检测mi R-302a-3p,miR-3130-3p表达水平;在对miR-302a-3p,miR-3130-3p进行干预后,Real-time PCR法检测LINC01016表达水平;构建LINC01016野生型及突变型表达载体,将其与miR-302a-3p,miR-3130-3p进行细胞共转染,双荧光素酶报告基因实验检测其与miR-302a-3p,miR-3130-3p的结合作用及结合位点。3、通过生物信息学软件TargetScan筛选出与miR-302a-3p,miR-3130-3p有潜在结合关系的转录因子NFYA,数据库检索筛选出SATB1的启动子区有NFYA的潜在结合序列;Real-time PCR及Western blot实验检测内膜癌中转录与翻译水平NFYA及SATB1的表达情况;构建NFYA野生型与突变型双荧光素酶报告基因载体,将其与miR-302a-3p/miR-3130-3p的agomir及antagomir进行细胞的共转染,检测NFYA与mi R-302a-3p/miR-3130-3p的互作关系及互作位点;通过Real-time PCR及Western blot实验检测LINC01016高表达及敲低的子宫内膜癌细胞中NFYA及SATB1在转录及翻译水平的表达变化;通过Real-time PCR及Western blot实验检测在转染了mi R-302a-3p,miR-3130-3p的agomir及antagomir后子宫内膜癌细胞中NFYA及SATB1在转录及翻译水平的表达变化;构建NFYA高表达及敲低的子宫内膜癌Ishikawa及RL-95-2细胞系,通过CCK-8,EdU,流式细胞周期,流式细胞凋亡,划痕实验,Transwell实验检测NFYA高表达及敲低的子宫内膜癌细胞系中细胞增殖,周期,凋亡,迁移及侵袭能力的改变;构建SATB1启动子区野生型及预测突变型荧光素酶报告载体,双荧光素酶报告基因实验检测SATB1与NFYA质粒共转后二者结合作用及结合位点;CHIP实验进一步检测NFYA与SATB1启动子区的互作关系;Real-time PCR及Western blot检测对NFYA表达水平进行干预后SATB1在转录及翻译水平的变化;裸鼠在体实验分析LINC01016与miR-302a-3p,miR-3130-3p对移植瘤大小的影响;Real-time PCR及Western blot检测各组瘤组织中NFYA与SATB1在转录及翻译水平的表达水平。结果:1、LINC01016在子宫内膜癌组织中的表达显著高于正常子宫内膜组织(p<0.05),CCK-8,EdU显示高转LINC01016后细胞增殖能力增强,G2-M期细胞显著增多,细胞整体凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)下降,划痕愈合实验显示高转LINC01016后愈合能力增加,Transwell结果显示高转LINC01016后细胞侵袭能力也增加(以上均p<0.05)。2、通过生物信息学软件筛查出202个与LINC01016互作的miRNA,通过双荧光素酶报告基因及Real-time PCR我们检测到在子宫内膜癌中具有差异性表达且与LINC01016呈互作关系的miR-302a-3p,miR-3130-3p(p<0.05);通过CCK-8,EdU,流式细胞周期,流式细胞凋亡,划痕实验,Transwell实验检测经miR-302a-3p,miR-3130-3p表达干预后细胞生物学行为变化,即增殖能力减弱,G2-M期细胞显著减少,细胞整体凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)升高,划痕愈合实验显示愈合能力减弱,Transwell结果显示细胞侵袭能力也减弱(以上均p<0.05);LINC01016表达水平的提高抑制了mi R-302a-3p/miR-3130-3p的表达,反之,miR-302a-3p/miR-3130-3p的高表达同样抑制LINC01016的表达(p<0.05);双荧光素酶报告基因表明LINC01016分别与miR-302a-3p/miR-3130-3p间存在2个和1个结合位点(p<0.05)。3、在子宫内膜癌组织中,NFYA及SATB1在RNA及蛋白水平均呈高表达(p<0.05);双荧光素酶报告基因实验表明miR-302a-3p/miR-3130-3p分别与NFYA的3’UTR区存在结合位点(p<0.05);在高转LINC01016的子宫内膜癌细胞中,NFYA与SATB1呈高表达,而在高转miR-302a-3p/miR-3130-3p的细胞中,NFYA与SATB1呈低表达(p<0.05);通过CCK-8,EdU,流式细胞周期,流式细胞凋亡,划痕实验,Transwell实验检测经NFYA表达干预后细胞生物学行为变化,即增殖能力增强,G2-M期细胞显著增加,细胞整体凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)下降,划痕愈合实验显示愈合能力增强,Transwell结果显示细胞侵袭能力也增强(以上均p<0.05);双荧光素酶报告基因及CHIP实验均证明NFYA与SATB1启动子区存在结合位点,NFYA的表达变化可调控SATB1的表达水平,二者成正相关(p<0.05);随着LINC01016的升高及miR-302a-3p/miR-3130-3p的降低,裸鼠成瘤体积增大,NFYA及SATB1的表达水平升高(p<0.05)。结论:1、LINC01016在子宫内膜癌组织中呈高表达且外源性升高LINC01016表达可促进细胞恶性生物学行为发生发展。2、LINC01016可与miR-302a-3p/miR-3130-3p形成负反馈调节环,其一方的外源性身高可抑制另一方的表达。miR-302a-3p/miR-3130-3p在子宫内膜癌组织中呈低表达且二者的外源性升高可抑制子宫内膜癌细胞的恶行生物学行为。LINC01016影响细胞生物学行为可通过调控miR-302a-3p/mi R-3130-3p实现。3、NFYA与SATB1在子宫内膜癌组织中皆呈高表达,且NFYA的外源性升高可促进癌细胞的恶性生物学行为。miR-302a-3p/miR-3130-3p存在与NFYA 3’UTR的结合位点,而NFYA可作为转录因子调控SATB1的启动子区进而调节SATB1的表达。LINC01016的外源性升高及miR-302a-3p/miR-3130-3p的外源性降低在细胞及裸鼠移植瘤中均可提高NFYA与SATB1在转录与翻译水平的表达。LINC01016调控miR-302a-3p/miR-3130-3p影响子宫内膜癌生物学行为可通过调控NFYA及SATB1来实现。