论文部分内容阅读
目的:实验研究凋亡抑制基因bcl-2反义寡核苷酸(ASODN)分别与癌基因c-mycASODN及促凋亡基因bax双基因联合转染对放疗诱导体外宫颈癌Hela细胞凋亡的影响,以及bcl-2 ASODN与bax联合转染对宫颈癌裸鼠皮下移植瘤生长及放疗作用的影响,从而探讨联合基因转染对宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用。方法:1.合成bcl-2 ASODN及c-myc ASODN并经阳离子脂质体介导行单基因及双基因转染Hela细胞。将Hela细胞按转染bcl-2 ASODN、c-myc ASODN、(bcl-2+c-myc)ASODN和对照组以及是否放射干预分为8组。通过平板克隆形成实验、MTT法、流式细胞仪等方法检测细胞增殖与凋亡,通过免疫组化及流式细胞仪等检测基因表达情况。2.构建bax基因的重组逆转录病毒表达载体pLXSN-bax,在阳离子脂质体介导下,将pLXSN-bax及bcl-2 ASODN分别行单基因及双基因转染至Hela细胞。将Hela细胞按转染bcl-2 ASODN、bax、bcl-2 ASODN+bax和对照组以及是否放射干预分为8组。通过细胞形态学、MTT法、流式细胞仪检测各组细胞增殖与凋亡,并通过RT-PCR检测bcl-2及bax基因表达情况。3.建立BALB/C裸鼠宫颈癌移植瘤模型,随机分成bcl-2 ASODN、bax、bcl-2ASODN+bax、bcl-2 SODN和对照组。移植成瘤后,开始基因转染,并定期测量肿瘤体积,计算抑瘤率。成瘤后21天给予6MV-X单次放疗,并采用缺口末端脱氧核苷酸转移酶标记技术(TUNEL法)检测移植瘤的细胞凋亡。结果:1.(1):平板克隆形成实验显示,Hela细胞经bcl-2 ASODN、c-myc ASODN单基因及双基因转染组并放疗后较对照组细胞存活分数显著减少,具有统计学意义(P<0.05);(2):流式细胞仪检测细胞凋亡率:(bcl-2+c-myc)ASODN联合转染、bcl-2 ASODN及c-myc ASODN单基因转染并放疗组的凋亡率分别为(11.83±0.57)%、(6.60±0.70)%、(10.29±0.66)%,均明显高于对照组,具有统计学意义(P<0.05);(3):MTT法分析放射增敏比:bcl-2 ASODN、c-myc ASODN、(bcl-2+c-myc)ASODN分别为1.20、1.53和2.18(以10%细胞存活为标准);(4):免疫组化及流式细胞仪等方法显示各转染组bcl-2及c-myc的表达均明显低于对照组。2.(1)从Hela细胞cDNA中克隆到野生型的Bax-α基因序列,将Bax-α基因定向克隆到逆转录病毒表达载体pLXSN中;(2):Hela细胞经bcl-2 ASODN+bax联合转染并放疗后,光镜观察有明显的凋亡趋势;(3):MTT法检测增殖抑制率:bcl-2ASODN+bax联合转染并放疗组细胞增殖抑制率为(63.4±4.6)%,而bax及bcl-2ASODN单基因转染并放疗组细胞增殖抑制率分别为(32.7±1.8)%、(37.8±2.0)%。联合转染并放疗组细胞增殖抑制率显著高于其它组包括单基因转染并放疗组,差异有统计学意义(P<0.05);(4):流式细胞仪检测细胞凋亡率:bcl-2 ASODN+bax联合转染未放疗组细胞凋亡率为(26.13±2.50)%,bax及bcl-2 ASODN单基因转染并放疗组凋亡率分别为(33.04±2.71)%和(38.22±2.94)%;联合基因转染并放疗组细胞凋亡率为(58.16±3.91)%,与前三者比较,差异均具有统计学意义(P<0.05);(5):RT-PCR显示转染组bax基因表达增强,bcl-2基因表达减弱。3.(1):25只裸鼠皮下移植Hela细胞后2周均达成瘤标准,基因转染17天后bcl-2 ASODN、bax及bcl-2 ASODN+bax组抑瘤率与bcl-2 SODN及对照组比较有显著差异(P<0.05);(2):放疗后第4天,双基因转染组抑瘤率为40.0%,与其它组比较有显著差异(P<0.05);(3).TUNEL法检测细胞凋亡结果显示:高倍镜视野下双基因转染组凋亡阳性细胞数为40.5±4.9个,与其它组比较有显著性差异。结论:1.成功构建了bax基因的逆转录病毒表达载体,通过反义寡核苷酸技术及逆转录病毒载体系统成功实现了Hela细胞bcl-2与c-myc基因的降调节以及bax基因的增强表达;2.在体外,(bcl-2+c-myc)ASODN双基因联合转染及单基因转染组均较对照组显著增加宫颈癌Hela细胞放射诱导凋亡,其中双基因转染效果更明显。bcl-2 ASODN+bax双基因联合转染较单基因转染组及对照组均能显著增强宫颈癌Hela细胞放射诱导凋亡;3.体内实验,bcl-2 ASODN与bax联合基因转染比单基因转染更能有效的促进肿瘤细胞凋亡,从而显著抑制放疗后裸鼠皮下移植瘤的生长;4.联合基因转染增强放射敏感性也许能成为一种新的治疗手段。