褶纹冠蚌α<,2>-巨球蛋白基因的分子克隆及表达

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褶纹冠蚌(Cristaria plicata)是我国重要的“淡水育珠蚌”之一,由于褶纹冠蚌容易感染蚌病,给其育珠能力产生了较大的影响。本文对褶纹冠蚌α2巨球蛋白基因的进行了克隆,并对其部分序列进行了表达。根据α2巨球蛋白基因(alpha-2Macrogloblin,α2M)序列同源性资料,利用简并引物RT-PCR、PCR Walk和5’RACE和3’RACE方法克隆出褶纹冠蚌α2M全长。该基因全长5621bp,其中编码区5226 bp,5’端不翻译区32bp,3’端不翻译区363 bp(含ployA尾31bp)。基因序列开放阅读框编码1741个氨基酸,其中前16个氨基酸残基为信号肽序列,成熟蛋白含1725个氨基酸残基,分子量为195 KDa,等电点为5.12,并含有7个N-link的糖基化位点。褶纹冠蚌与其它动物α2M基因一样含有三个功能区:诱饵区(bait region),内部硫酯键(internal thiol ester)和受体结合区(receptor-binding domain)。经序列比对和系统发育树分析表明褶纹冠蚌与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)和栉孔扇贝(Chlamys ferrari)的α2M基因具有非常高的同源性。利用RT-PCR分析检测α2M基因在褶纹冠蚌不同组织的表达情况,结果发现α2M仅在血细胞中有表达,而在外套膜、闭壳肌、肝胰腺和性腺中没有表达。注射嗜水气单胞菌6,12,24 h后,褶纹冠蚌体内α2M的表达水平有一定量的升高,证明α2M是褶纹冠蚌基础免疫系统中的重要组成部分。选择褶纹冠蚌α2M基因包含有受体结合区片段的第1138-1606氨基酸设计含有酶切位点的表达引物,构建重组表达质粒,经过IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE分析表达产物。结果表明重组的α2M在大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta-gami(DE3)中获得了表达,产物为69KDa的融合蛋白。
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