近年来恶性肿瘤治疗常规的治疗手段手术、放疗、化疗都遇到了相应的瓶颈。随着人们对肿瘤发生发展与机体免疫关系认识的提高,生物治疗已成为对抗肿瘤又一手段。生物治疗包括细胞治疗和非细胞治疗(基因治疗、小分子靶向药物治疗、抗血管生成治疗、基因疫苗、单克隆抗体治疗、多肽或蛋白质疫苗等)。细胞免疫治疗通过向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫细胞,直接杀伤肿瘤细胞或激发机体抗肿瘤免疫反应,从而达到治疗肿瘤的目的,称为肿瘤过继细胞治疗(adoptive cell transfer,ACT)。细胞免疫治疗的核心是诱导T细胞活化并识别肿瘤抗原,从而产生肿瘤杀伤。主要有两种模式,一是DC诱导的T细胞免疫,主要通过负载相应抗原的DC,将抗原信息提呈给T细胞,使T细胞活化并能特异性识别和杀伤肿瘤细胞;二是T细胞工程制备的T细胞免疫,主要是通过T细胞的基因转染或基因编辑,使T细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤细胞。其中,DC诱导的T细胞免疫,是细胞免疫治疗的重要研究方向。目前临床多采用外周血提取单个核细胞进行扩增活化,应用自体或异体肿瘤细胞制备抗原,进而制备抗原特异性杀伤细胞,对患者进行过继回输治疗,取得了一定的疗效。但因肿瘤患者自身状况、T细胞功能状态、抗原的特异性、以及肿瘤微环境等问题限制了其临床有效性。首先,目前临床应用的DC细胞和T细胞的来源主要通过患者自体外周血单个核细胞采集。而肿瘤的“免疫抑制微环境”导致自体DC和T细胞的功能障碍及数量不足,晚期肿瘤患者不能耐受大量的外周血单个核细胞的采集及个体化限制等问题,致使临床采集DC和T细胞所制备的效应细胞功能和数量存在缺陷,以及效应细胞制备的规模化和产业化受限。近些年有研究表明,不同的T细胞亚群制备的效应细胞具有不同的抗肿瘤效应。其中,初始T细胞亚群相较于记忆性T细胞具有更强的抗肿瘤能力。脐带血来源的T淋巴细胞较外周血来源T淋巴细胞具有更强的扩增及活化能力,目前广泛应用于血液系统肿瘤,而且针对实体肿瘤亦表现出了较强的杀伤效率。但目前还没有研究具体分析脐带血来源初始T细胞亚群的抗肿瘤能力。其次,自体肿瘤抗原临床难以获取,是临床制备肿瘤特异性、治疗型DC疫苗及肿瘤特异性T杀伤细胞制剂的难点,因而,寻找具有临床通用性的肿瘤抗原,是目前研究重点之一。上皮细胞粘附分子(epithelial-specific cell adhesion molecule,Ep CAM)是最早发现的肿瘤相关抗原之一,但最初并没有作为肿瘤治疗的靶点而得到相应的重视。Ep CAM在多种腺癌细胞表面表达明显升高,包括乳腺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌等。近年来,随着靶向药物的广泛应用和取得的良好成果,Ep CAM作为细胞免疫治疗新靶点的研究受到高度关注,已有研究表明,Ep CAM靶向T效应细胞制剂,能够获得良好的临床杀伤效率。而以Ep CAM为靶向抗原,诱导脐血来源初始T杀伤效率研究尚未得到实验证实。本研究旨在探讨脐血来源初始T细胞亚群的扩增活化能力及体内外抗肿瘤能力,以及Ep CAM纯蛋白诱导DC成熟,进而制备Ep CAM特异性CTL,并探讨其对高表达Ep CAM的腺癌细胞的体内外杀伤效应,为突破个体化限制,实现规模化、产业化制备效应细胞,提供初步的实验数据和理论依据。第一部分脐带血来源初始T细胞增值活化能力的实验研究目的:从脐带血中分离并大量扩增初始T细胞,并验证其大批量扩增和活化能力。方法:密度梯度离心法分离获取脐带血及外周血单状核细胞,CD45RO磁珠阴性筛选脐带血单状核细胞,进一步CD62L磁珠阳性筛选获取CD62L+CD45RO-的初始T淋巴细胞。MTS法检测T淋巴细胞的增殖活性。ELISA法检测T淋巴细胞分泌IFN-γ的能力。流式方法检测T细胞表面抗原CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD62L的表达。结果:1初始T细胞是脐带血及外周血T细胞中最大的亚群,脐带血中初始T细胞亚群占67.57±6.53%;外周血中初始T细胞亚群占50.66±5.79%。2脐带血中初始T细胞比例较外周血中初始T细胞比例高(P<0.05);3脐带血及外周血来源的初始T细胞增殖能力高于其他亚群(P<0.05);4脐带血初始T细胞增殖能力显著高于外周血初始T细胞(P<0.05);5经2周培养扩增后,脐带血CD45RA+CD62L+T细胞比例显著高于外周血(P<0.05);6经2周培养扩增后,CD8+T细胞比例逐渐升高,脐带血来源初始T更显著(P<0.05);7经2周培养扩增后,相较于外周血来源初始T细胞及其他亚群,脐带血来源初始T细胞仍为较低的IFN-γ分泌能力(P<0.05)。结论:脐带血中具有丰富的初始T细胞,而且相对于外周血来源初始T细胞,具有更强的增殖活化能力,而且经扩增培养后,其细胞表面CD62L、CD45RA仍高表达,而分泌能力弱,继续保持初始状态。第二部分Ep CAM诱导DC成熟及诱导T细胞活化的实验研究目的:通过Ep CAM诱导DC成熟,进而激活初始T细胞制备细胞毒T淋巴细胞。方法:密度梯度离心法分离脐带血及外周血单状核细胞,贴壁法获得DC细胞。扩增培养后分别用cocktail(TNF-α,IL1β,IL-6,IFN-γ,poly I:C)+肿瘤细胞裂解物、cocktail+Ep CAM刺激DC细胞成熟。流式方法检测未成熟DCs(im DCs)及成熟DCs(m DCs)表面HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表达量。成熟DCs与初始T细胞共培养,进而活化初始T细胞成为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。流式方法检测CTL细胞表面CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD62L的表达。ELISA法检测CTL细胞分泌IFN-γ的能力。结果:1刺激DC成熟后,DC表面的HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表达较成熟前明显升高(P<0.05);2通过cocktail+肿瘤裂解物或cocktail+Ep CAM刺激的成熟DC之间表面抗原的表达无明显差异(P>0.05);3脐带血来源DC成熟与外周血来源DC成熟后表面分子表达水平无明显差异(P>0.05);4制备的CTL细胞表面抗原CD45RA、CD62L表达水平显著下降,脐带血来源CTL细胞更为明显(P<0.05),但通过不同DC活化的CTL细胞之间无显著差异(P>0.05);5脐带血来源CTL细胞比外周血来源CTL细胞CD8+所占比例高(P<0.05);但通过不同DC活化的CTL细胞之间无显著差异(P>0.05);6脐带血来源CTL细胞较外周血来源CTL细胞具有更强的IFN-γ分泌能力(P<0.05);初始T细胞来源CTL细胞比记忆T细胞来源CTL细胞具有更强的IFN-γ分泌能力(P<0.05);但通过不同DC活化的CTL细胞之间无显著差异(P>0.05)。结论:通过Ep CAM或肿瘤裂解物均可刺激DC细胞成熟,并能进一步活化初始T细胞成为细胞毒性T淋巴细胞;脐带血来源的CTL具有更强的活化及分泌能力,其中初始T细胞来源的CTL拥有更强的活化及分泌能力。第三部分制备的CTL在体内外对Ep CAM抗原高表达肿瘤的特异性杀伤效应研究目的:验证制备的CTL细胞的体内外特异性杀伤效应。进一步评估应用脐带血初始T细胞批量制备Ep CAM抗原特异性CTL的可行性。方法:1流式方法检测靶细胞LS174-T、Pa Ca-2表面Ep CAM的表达情况。2各命名简写方式:脐带血(cord blood,CB);外周血(peripheral blood,PB);初始T细胞(na?ve T cell,n);记忆T细胞(memory T cell,m);Ep CAM抗原(Ep);肿瘤裂解物(tumor lysate,T);细胞毒T细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL);3脐带血来源初始T细胞与记忆T细胞制备的CTL体外杀伤实验。分组:(1)实验组(初始T细胞制备的CTL,CB-CTLn),包括Ep CAM诱导活化的CTL(CB-Ep-CTLn)及肿瘤裂解物活化的CTL(CB-T-CTLn);(2)对照组(记忆T细胞制备的CTL,CB-CTLm),包括Ep CAM诱导活化的CTL(CB-Ep-CTLm)及肿瘤裂解物活化的CTL(CB-T-CTLm);(3)空白对照组;靶细胞:LS174-T;应用MTS法检测效应细胞对靶细胞的杀伤效应。4外周血来源初始T细胞与记忆T细胞制备的CTL体外杀伤实验。分组:(1)实验组(初始T细胞制备的CTL,PB-CTLn),包括Ep CAM诱导活化的CTL(PB-Ep-CTLn)及肿瘤裂解物活化的CTL(PB-T-CTLn);(2)对照组(记忆T细胞制备的CTL,PB-CTLm),包括Ep CAM诱导活化的CTL(PB-Ep-CTLm)及肿瘤裂解物活化的CTL(PB-T-CTLm);(3)空白对照组;靶细胞:LS174-T;应用MTS法检测效应细胞对靶细胞的杀伤效应。5脐带血与外周血来源初始T细胞制备的CTL体外杀伤实验。(1)实验组(CB-Ep-CTLn、CB-T-CTLn);(2)对照组(PB-Ep-CTLn、PB-T-CTLn);(3)空白对照组(PBS)。6体外特异性杀伤验证。分组:(1)实验组(CB-Ep-CTLn、CB-Ep-CTLm、PB-Ep-CTLn、PB-Ep-CTLm),靶细胞:LS174-T;(2)对照组(CB-Ep-CTLn、CB-Ep-CTLm、PB-Ep-CTLn、PB-Ep-CTLm),靶细胞:Pa Ca-2、LS174-T(用抗Ep CAM抗体阻断细胞表面Ep CAM抗原);(3)空白对照组(PBS),靶细胞:LS174-T、Pa Ca-2;MTS法检测效应细胞对靶细胞的杀伤效应。7制备动物模型。实验动物:4周龄雄性NOD/SCID小鼠。取1×106个靶细胞(0.1ml)于NOD/SCID小鼠左前肢内侧皮下注射,大约10天后,肿瘤平均大小为0.5mm3(体积=长度×宽度2÷2)。8脐带血来源初始T细胞与记忆T细胞制备的CTL体内抑瘤效应。分组:(1)实验组(CB-Ep-CTLn、CB-T-CTLn);(2)对照组(CB-Ep-CTLm、CB-T-CTLm);(3)空白对照组(PBS);LS 174-T荷瘤小鼠尾静脉注射1×107个效应细胞,隔天测量肿瘤大小,以肿瘤体积达到2 mm3为观察终点。9外周血来源初始T细胞与记忆T细胞制备的CTL体内抑瘤效应。分组:(1)实验组(PB-Ep-CTLn、PB-T-CTLn);(2)对照组(PB-Ep-CTLm、PB-T-CTLm);(3)空白对照组(PBS);LS 174-T荷瘤小鼠尾静脉注射1×107个效应细胞,隔天测量肿瘤大小,以肿瘤体积达到2 mm3为观察终点。10体内特异性抑瘤效应验证。分组:(1)实验组(CB-Ep-CTLn、CB-Ep-CTLm、PB-Ep-CTLn、PB-Ep-CTLm),实验组动物:LS174-T荷瘤小鼠;(2)对照组(CB-Ep-CTLn、CB-Ep-CTLm、PB-Ep-CTLn、PB-Ep-CTLm),实验组动物:Pa Ca-2荷瘤小鼠;(3)空白对照组(PBS),实验动物:LS174-T荷瘤小鼠、Pa Ca-2荷瘤小鼠;尾静脉注射1×107个效应细胞,隔天测量肿瘤大小,以肿瘤体积达到2 mm3为观察终点。结果:1 LS174-T细胞表面抗原Ep CAM表达为99.22±0.42%;Pa Ca-2细胞表面抗原Ep CAM表达为5.69±0.89%。两者满足作为针对Ep CAM特异性杀伤研究靶细胞的要求。2 CB-Ep-CTLn较CB-Ep-CTLm对LS174-T细胞有更强的体外杀伤效应(P<0.05);CB-T-CTLn较CB-T-CTLm对LS174-T细胞有更强的体外杀伤效应(P<0.05)。CB-Ep-CTLn较CB-T-CTLn对LS174-T细胞有更强的体外杀伤效应(P<0.05)。CB-Ep-CTLm与CB-T-CTLm对LS174-T细胞的体外杀伤无明显差异(P>0.05)。3 PB-Ep-CTLn较PB-Ep-CTLm对LS174-T细胞有更强的体外杀伤效应(P<0.05);PB-T-CTLn较PB-T-CTLm对LS174-T细胞有更强的体外杀伤效应(P<0.05);PB-Ep-CTLn较PB-T-CTLn对LS174-T细胞有更强的体外杀伤效应(P<0.05)。PB-Ep-CTLm与PB-T-CTLm对LS174-T细胞的体外杀伤无明显差异(P>0.05)。4 CB-Ep-CTLn较PB-Ep-CTLn对LS174-T细胞有更强的体外杀伤效应(P<0.05);CB-T-CTLn较PB-T-CTLn对LS174-T细胞有更强的体外杀伤效应(P<0.05)。5 CB-Ep-CTLn对LS174-T体外杀伤效应强,对Pa Ca-2体外杀伤效应弱(P<0.05);PB-Ep-CTLn对LS174-T体外杀伤效应强,对Pa Ca-2体外杀伤效应弱(P<0.05);在靶细胞中事先加入抗Ep CAM抗体后,CB-Ep-CTLn、PB-Ep-CTLn对LS174-T靶细胞的杀伤效应均出现明显下降(P<0.05)。6 CB-Ep-CTLn较CB-Ep-CTLm对LS174-T荷瘤小鼠具有更强的抑瘤作用(P<0.05);CB-T-CTLn较CB-T-CTLm对LS174-T荷瘤小鼠有更强的抑瘤作用(P<0.05);CB-Ep-CTLn较CB-T-CTLn对LS174-T荷瘤小鼠有更强的抑瘤作用(P<0.05)。7 PB-Ep-CTLn较PB-Ep-CTLm对LS174-T荷瘤小鼠具有更强的抑瘤作用(P<0.05);PB-T-CTLn较PB-T-CTLm对LS174-T荷瘤小鼠有更强的抑瘤作用(P<0.05);PB-Ep-CTLn较PB-T-CTLn对LS174-T荷瘤小鼠有更强的抑瘤作用(P<0.05)。8 CB-Ep-CTLn较PB-Ep-CTLn对LS174-T荷瘤小鼠具有更强的抑瘤作用(P<0.05);CB-T-CTLn较PB-T-CTLn对LS174-T荷瘤小鼠有更强的抑瘤效应(P<0.05)。9 CB-Ep-CTL对LS174-T荷瘤小鼠有强的抑瘤作用,对Pa Ca-2荷瘤小鼠抑瘤作用不明显(P<0.05);PB-Ep-CTL对LS174-T荷瘤小鼠有较强的抑瘤作用,对Pa Ca-2荷瘤小鼠抑瘤作用不明显(P<0.05)。结论:1脐带血或外周血来源的初始T细胞制备的CTL较记忆T细胞制备的CTL在体内外具有更强的抗肿瘤能力。2通过Ep CAM诱导的CTL较肿瘤裂解物诱导的CTL具有更强的抗肿瘤能力。3脐带血来源的初始T细胞制备的CTL较外周血来源的初始T细胞制备的CTL具有更强的抗肿瘤能力。4通过Ep CAM诱导的CTL具有针对高Ep CAM表达肿瘤的特异性杀伤能力。