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白芍总苷(total glucosides of paeony,TGP)是从毛茛科植物白芍根部提取的有效成分,其药效成分主要含有芍药苷(paeoniflorin,Pae)、羟基芍药苷、芍药花苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷。Pae是TGP含量最多的活性成分,Pae和TGP均有一定的抗炎和免疫调节作用。TGP是第一个来源于植物并作为抗炎免疫调节药上市的抗类风湿药物,临床长期用药实践证明TGP不仅能改善关节炎病人的症状,同时在长期用药的过程中不良反应极少,无明显毒副作用。然而TGP在临床的起效较慢,TGP和Pae的抗炎和免疫调节作用也较弱。文献报道单次给大鼠灌胃(intragastric administration,ig)Pae,其绝对生物利用度仅仅为3-4％,因此作为TGP主要药效成分之一的Pae的吸收较差可能是其起效慢以及药理活性较弱的原因之一。Pae口服吸收较差原因之一是其脂溶性较差,而Pae脂溶性较差主要是由于其分子结构上的亲水性羟基数目较多。因为Pae的天然来源广泛,以Pae为原料药进行结构修饰适于工业化生产,故本课题通过酯化修饰对Pae进行结构改造,以期得到一个吸收较高,抗炎和免疫调节活性更强的化合物。 二甲苯和大鼠角叉菜胶诱导的是急性炎症反应,而小鼠迟发型变态反应(Delayed type hypersensitivity,DTH)是经典的慢性免疫性炎症和细胞免疫失衡,因此被用来考察CP-25的抗炎和免疫调节活性。本文通过核磁共振技术(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)和质谱(Mass Spectrometry,MS)对Pae酯化修饰产物CP-25进行结构鉴定,并考察其最佳的合成工艺;考察CP-25的理化性质;研究CP-25在肝匀浆液和肠匀浆液的体外降解情况,为CP-25药物剂型设计提供一定的依据;考察静脉注射(intravenous,iv)和ig后,CP-25在大鼠体内的药代动力学过程,并与相同给药途径的Pae比较药动学差异;通过二甲苯模型和角叉菜胶模型考察CP-25是否具有抗急性炎症的作用,通过DTH模型考察CP-25对慢性炎症抑制作用和对细胞免疫失衡的调节作用,同时将CP-25的抗炎和免疫调节活性分别与Pae和TGP相比较。为开发新药CP-25提供一定的实验依据。 目的:1.合成CP-25并对其进行结构鉴定和工艺优化;2.考察CP-25的理化性质;3.考察CP-25在肠匀浆液和肝匀浆液的降解情况;4.考察大鼠ig和iv CP-25的药动学特征,并与Pae比较;5.考察CP-25是否具有抗炎和免疫调节活性,并与Pae和TGP进行比较。 方法:1.采用常规酰化反应对CP-25进行合成,利用MS和NMR对其进行结构鉴定,以CP-25的产率和Pae的回收率为指标,考察最佳的物料配比、催化剂、反应温度、反应时间和反应溶剂;2.建立CP-25和Pae的高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)定量分析方法,考察其溶解度、稳定性和油水分配系数;3.建立大鼠肝匀浆液和肠匀浆液中CP-25的HPLC定量分析方法,考察CP-25在肝匀浆液和肠匀浆液的降解情况;4.建立大鼠血浆中CP-25和Pae的HPLC定量分析方法,考察iv以及ig CP-25在大鼠体内的药动学特征,并与Pae进行比较;5.分别建立小鼠二甲苯和大鼠角叉菜胶模型,以耳片和关节肿胀度为指标,考察CP-25对急性炎症的抑制作用,并与TGP和Pae进行比较;建立小鼠DTH模型,以耳片肿胀度、胸腺指数、脾脏指数、组织病理学、T细胞增殖能力、白细胞介素(Interleukin-2,IL-2)、IL-4、IL-10和IL-17的含量水平等方面考察CP-25对DTH小鼠慢性炎症的抑制作用以及免疫调节作用,同时与TGP和Pae进行比较。 结果: 1.CP-25是Pae-6′-O单取代苯磺酸酯;其分子量为620,分子式为C29H32O13S,化学名为[(1aR,2S,3aR,5R,5aR,5bS)-5b-[(苯酰氧基)甲基]-3a,5,5a,5b-四氢-5-羟基-2甲基-2,5亚甲基-3,4二氧杂-1H-环丁并环戊二烯-1a(2H)]6氧-苯磺酰基-β-D-吡喃糖;CP-25产率为20%左右,其最佳合成工艺为1g Pae、20ml吡啶、20ml三氯甲烷和25mg的4-二甲氨基吡啶相互混合,在室温下4小时内,将苯磺酰氯溶液(0.4ml苯磺酰氯溶解在150ml的丙酮中)缓慢滴加到三口瓶中,滴加完毕后,继续搅拌8小时,直至中止反应;采用最佳合成工艺连续四批CP-25,其纯度依次为99.0%,98.80%,98.0%,98.30%。 2.CP-25是白色结晶状粉末有轻微的引湿性;微溶于水和石油醚,易溶于氯仿、甲醇和乙酸乙酯等有机溶剂;CP-25稳定性主要影响因素为湿度,CP-25的油水分配系数明显大于Pae;CP-25紫外最大吸收波长在230nm。 3.CP-25在肝脏和肠匀浆液能明显降解,在肝匀浆液(5%,10%,25%)和肠匀浆液(2.5%,5%,12.5%),CP-25的半衰期依次为:4.60±0.47h,4.07±1.38h,3.45±0.89h,9.05±1.12,8.46±3.12,4.12±0.31;在肠道各区段中,以空肠和回肠对CP-25的降解作用较强,在十二直肠,空肠,回肠和结肠,CP-25的半衰期依次为:17.50±3.00h,6.64±3.25h,6.14±3.12h,19.69±6.23h。 4.CP-25在大鼠血浆可以代谢分解出Pae;与iv Pae的药动学参数相比较,CP-25在大鼠体内消除半衰期(t1/2β)较长,平均滞留时间(MRT)明显延长,清除率和体内表观分布容积均明显增加;正常大鼠iv CP-25(6,12,24mg.kg-1)药代动力学参数依次为: 分布相半衰期(T1/2α)为4.28±0.81、5.67±2.00、6.60±1.71min;消除相半衰期(T1/2β)为161.99±57.54、152.81±61.16、153.76±35.33min;药时曲线下面积(AUC(0-tn))为65.13±14.16、154.20±28.91、335.16±86.32mg/L*min;药时曲线下面积(AUC(0-∞))为82.66±16.16、222.51±48.55、514.51±135.49mg/L*min;平均滞留时间(MRT(0-tn))为59.69±2.36、57.76±12.04、64.75±6.24min;平均滞留时间(MRT(0-∞))为115.22±23.49、135.76±33.05、170.95±34.97min;表观分布容积(V)为2.38±0.18、2.67±1.00、3.01±0.67 L/kg;清除率(CL/F)为0.06±0.01、0.05±0.01、0.05±0.01L/min/kg;CP-25口服吸收过程属于一级动力学,口服CP-25的吸收明显多于Pae,两者的绝对生物利用度依次为11.0%,3.6%;与口服Pae药动学参数相比较,CP-25吸收半衰期(t1/2α)、消除半衰期(t1/2β)和平均滞留时间(MRT)明显较长,药时曲线下面积(AUC)以及表观分布容积(Vd)均高于Pae;正常大鼠ig CP-25(32,64,128mg.kg-1),药代动力学参数依次为:吸收相半衰期(T1/2α)为1.35±0.30、1.49±0.60、2.04±0.43h;消除相半衰期(T1/2β)为1.44±0.25、2.12±0.42、2.11±0.48h;表观分布容积(V)为92.40±36.34、147.52±51.19、146.67±31.04L/kg;清除率(CL/F)为49.79±8.75、66.67±3.94、58.17±6.91L/h/kg;药时曲线下面积(AUC(0-tn))为0.40±0.04、0.71±0.05、1.78±0.14mg/L*h;药时曲线下面积(AUC(0-∞))为0.66±0.12、0.96±0.06、2.23±0.26mg/L*h;平均滞留时间(MRT(0-tn))为2.71±0.06、3.40±0.05、4.30±0.25 h;平均滞留时间(MRT(0-∞))为5.17±1.26、5.43±1.05、5.61±0.69h;达峰时间(Tmax)为2.50±0.35、2.60±0.22、3.2±0.45h;峰浓度(Cmax)为0.12±0.01、0.19±0.03、0.44±0.09μg·ml-1; 5.CP-25能明显抑制二甲苯和角叉菜胶诱导的急性炎症,CP-25对急性炎症的抑制作用要强于TGP和Pae给药组;CP-25能明显抑制DTH小鼠耳片的慢性炎症,改善其耳片和脾脏组织病理学;抑制胸腺指数、脾脏指数和T细胞增殖;提高淋巴细胞和血清中IL-4,IL-10的含量,同时降低IL-2和IL-17的分泌;CP-25对小鼠DTH慢性炎症的抑制作用以及免疫调节作用要明显强于TGP和Pae给药组。 结论： 1.CP-25是Pae-6′-O单取代苯磺酸酯,经中国专利数据库、美国化学文摘、美国专利数据库、欧洲专利数据库和日本专利局等检索系统检索,未见与CP-25相关的报道,CP-25的合成工艺简便、快速,产量较大,基本可适用中试。 2.CP-25易吸湿,微溶于水,影响其稳定性的主要因素湿度,在储层过程中要尽量保持干燥,CP-25脂溶性明显高于Pae。 3.口服CP-25存在明显的首关效应。 4.CP-25的口服吸收明显高于Pae,CP-25在体内分布比Pae广,CP-25在体内消除慢于Pae。 5.CP-25具有比Pae和TGP更强的抗炎和免疫调节作用。