研究背景：姜黄系姜科植物姜黄的干燥根茎,具有行气破淤、活血止痛、清心解郁等功效,是临床治疗腹痛、胃炎及跌打肿痛的常用中药。其主要化学成分姜黄素(Curcumin)是一种多酚类化合物,由于其色泽稳定且毒性极低,己广泛应用于食品添加剂和染料中。姜黄素药理作用包括抗肿瘤、逆转肿瘤对化疗药物产生的多药耐药、抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗艾滋病毒等作用。由于姜黄素在肿瘤中的作用,目前美国国立肿瘤研究所已将姜黄素列为第三代肿瘤预防药,并进行了前期的临床研究。大肠癌在世界各地都是一种比较常见的恶性肿瘤,在我国常见恶性肿瘤死亡率位次中居第5位,次于胃癌、食道癌、肝癌、肺癌。但从近年的统计资料来看,随着人民生活水平的提高,饮食结构等各个方面的变化,我国结直肠癌发病率是逐年上升的,目前结直肠癌在我国大多数地区已经成为发病率上升最快的恶性肿瘤之一,所以如何预防大肠癌的发生以及对已患大肠癌患者进行早诊断、早治疗是目前的研究热门课题,针对大肠癌的治疗,化疗是大肠癌综合治疗的重要组成部分。伊立替康与5-FU、LV组成的FOLFIRI方案是目前治疗进展期大肠癌的标准化疗方案之一,伊立替康是从我国特有植物喜树中提取的半合成喜树碱衍生物,其抗肿瘤的机制为：伊立替康及体内活性代谢物SN-38可以与肿瘤细胞的拓扑异构酶Ⅰ活性部位结合,形成稳定的拓扑异构酶-DNA断裂复合物,抑制拓扑异构酶Ⅰ的活性,干扰肿瘤细胞DNA单链再连接,使肿瘤细胞内DNA链断裂,促使肿瘤细胞的凋亡,尤其对处于S期的细胞毒性更大,其中,拓扑异构酶是真核细胞和原核细胞中的基本酶,广泛分布于细胞核内,在复制、转录、翻译、重组及染色体单体分离等过程中控制、维持和修饰DNA的拓扑结构,其中,DNA拓扑异构酶可分为DNA拓扑异构酶Ⅰ和DNA拓扑异构酶Ⅱ,拓扑异构酶Ⅰ主要催化瞬时单链的断裂和连接,拓扑异构酶Ⅱ主要催化双链的断裂和连接。由于拓扑异构酶在肿瘤组织中高表达,使拓扑异构酶成为许多抗肿瘤药物的作用靶点。但是,随着伊立替康在临床上的广泛应用,研究发现,其治疗的有效率约为49%,影响其疗效的主要原因是肿瘤细胞对其产生多药耐药。其中,经伊立替康作用后,大肠癌细胞拓扑异构酶Ⅰ表达的下调,致使伊立替康的作用靶点减少是肿瘤细胞对伊立替康产生多药耐药的原因之一。同时,临床研究资料显示伊立替康对拓扑异构酶Ⅰ高表达的患者的化疗效果非常佳。所以,上调拓扑异构酶Ⅰ的表达有利于增加伊立替康的作用靶点,增强其对肿瘤细胞的杀伤作用故逆转肿瘤细胞对伊立替康产生的多药耐药,是增强伊立替康对大肠癌细胞杀伤作用的关键。姜黄素与化疗药物的协同作用是目前的研究热门,既往的研究发现姜黄素可以通过不同的作用机制增强化疗药物的疗效,逆转肿瘤细胞对化疗药物产生的多药耐药,在大肠癌中,研究发现姜黄素可以通过调控上皮生长因子受体(EGFR)及胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)信号通路,抑制上皮生长因子受体(EGFR)及胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)的表达,增强5-FU及奥沙利铂对大肠癌细胞株HCT-116及HT-29的杀伤作用,故本研究拟使用具有逆转肿瘤多药耐药的中药姜黄素联合伊立替康,作用于大肠癌lovo细胞,观察姜黄素与伊立替康是否具有协同作用,姜黄素是否可以增强伊立替康对lovo细胞的杀伤作用,并进一步研究姜黄素对lovo细胞中拓扑异构酶Ⅰ影响,姜黄素是否可以上调拓扑异构酶Ⅰ的表达,增加伊立替康的作用靶点而增强伊立替康对lovo细胞的杀伤作用,从而为两者在临床的联合应用提供实验依据。目的：研究姜黄素、伊立替康及两者联合对体外培养大肠癌lovo细胞生长的影响,明确两者对大肠癌lovo细胞协同作用及其有效的联合给药方式,并探索两者协同作用机制。方法：一、MTT法检测不同浓度的姜黄素及伊立替康在不同时间对大肠癌lovo细胞增殖的影响：配制不同浓度的姜黄素及伊立替康溶液,其中姜黄素溶液按浓度为1.25、2.5、5、10、15、20、30、40μ g/m配制,伊立替康溶液按浓度1.925、3.85、7.7、15.4、30.8、61.6、132.2μg/ml配制,体外培养的大肠癌lovo细胞消化后按5*103／孔接种于96孔板中,设立实验组、阴性对照组及空白组,每组重复6个孔,在各个实验组分别加入预配制的姜黄素溶液和伊立替康溶液,避光条件下分别作用24、48、72、96、120h,在每个终止时间点用MTT法分别检测姜黄素、伊立替康对lovo细胞增殖的影响,分别计算两者对lovo细胞抑制率及绘制生长抑制曲线,筛选出姜黄素对lovo细胞增殖无抑制作用的最大浓度和伊立替康对lovo细胞在不同时间点的半抑制浓度(工C5。)；二、流式细胞术检测经不同方式联合姜黄素和伊立替康在不同作用时间对大肠癌lovo细胞的凋亡率：按3*105/ml的密度将lovo细胞接种于60mm2的培养皿中,分别用两药混合法(按姜黄素：伊立替康=1：1的比例配制两药混合液,其中姜黄素实验浓度分别为5、10μg/ml,伊立替康实验浓度为56.201μg/ml,设立对照组及实验组,每组设立6个平行组)和贯序给药法(先用姜黄素作用24、48h,再用伊立替康作用24h,实验药物浓度及分组同上)联合姜黄素和伊立替康作用于lovo细胞,在每个终止时间点用流式细胞术检测每组lovo细胞的凋亡率；三、应用RT-PCR、免疫荧光、western blot分别检测经不同浓度姜黄素在不同作用时间处理lovo细胞拓扑异构酶I mRNA及蛋白水平的表达：按3*105/ml的密度将lovo细胞接种于60mm的培养皿中,设立对照组及实验组,每组设立3个平行组,姜黄素实验浓度分别为5、10μg/ml,作用时间分别为24、48h,在每个终止时间点应用RT-PCR、免疫荧光、western blot分别检测lovo细胞拓扑异构酶ImRNA及蛋白水平的表达,对westem印迹胶片用Gel-Pro Analyzer软件进行光密度扫描定量分析,用目的蛋白和β-actin的积分光密度值(IOD)的比值来反映蛋白的相对表达水平。结果：一、不同浓度姜黄素在不同作用时间对lovo细胞增殖的影响：不同浓度姜黄素作用于大肠癌Lovo细胞后,随着作用浓度增高,作用时间加长,lovo细胞增殖水平明显下降,姜黄素呈时间、剂量依赖型方式抑制大肠癌细胞增殖,其中,5μg/ml是姜黄素对lovo细胞的增殖无抑制作用的最大浓度,在不同的作用时间点,其在570nm波长下测得吸光度值与阴性对照组比较,两组间无统计学差异(P24h=0.518、P48h=0.433、P72h=0.222、P96h=0.648、P120h=0.117)(如图1所示)二、不同浓度伊立替康在不同作用时间对lovo细胞增殖的影响：在不同时间段,不同浓度伊立替康对lovo细胞的半抑制浓度分别为IC5024h=56.201μg/ml、IC5048h=21.183μg/ml、IC5072h=20.211a g/ml、IC5096h=17.246μg/ml、IC50120h=7.891μg/ml,其对lovo细胞增殖抑制方式亦呈时间、剂量依赖性(如图2所示)；三、不同给药方式联合姜黄素及伊立替康在不同作用时间诱导lovo细胞凋亡率：(一)混合给药法：姜黄素+伊立替康联合组与伊立替康单药组对比,作用24h两组间对lovo细胞的早期凋亡率显著高于伊立替康单药组,两组间的差异有统计学意义(P=0.029),但晚期、总凋亡率两组间无统计学差异(P=0.314、0.229)；作用48h,两组间的早期、晚期及总凋亡率两药联合组均显著性高于伊立替康单药组,两组间差异有统计学意义(P=0.008、0.001、0.000)(如图3、4所示)；(二)贯序给药法：实验组与阴性对照组比较,经姜黄素处理组中伊立替康对lovo细胞的凋亡率明显增加,并随着姜黄素的浓度增加,作用时间延长,凋亡率也增加,两组间联合组显著性高于单药组,两组间差异有统计学意义(P<0.05)(如图5、6所示)；(三)不同给药方式的比较：与混合给药处理组比较,贯序给药处理组中经5μg/ml姜黄素作用24h中伊立替康对lovo细胞的早中晚期凋亡率均显著性高于24h两药联合组,两组间差异有统计学意义(P<0.05)；作用48h,伊立替康的早中晚期凋亡率亦显著性高于48h两药联合组,两组间差异有统计学意义(P<0.05)。(如表1、2所示)。四、不同浓度姜黄素在不同作用时间诱导lovo细胞拓扑异构酶Ⅰ蛋白的表达：与对照组相比,各实验组在作用24、48h均上调lovo细胞拓扑异构酶Ⅰ蛋白的表达,呈时间、剂量依赖性(如图7、8所示)。五、不同浓度姜黄素在不同作用时间诱导lovo细胞拓扑异构酶ImRNA的表达：作用24小时,5μg/ml处理组与阴性对照组相比,拓扑异构酶ImRNA的表达之间差异没有统计学意义(P=0.952),但10μg/ml处理组可以显著性上调拓扑异构酶ImRNA表达,两组间的差异有统计学意义(P=0.05)；作用48小时,5μg/ml处理组与阴性对照组相比,亦没有统计学差异(P=0.952),但10μg/ml处理组显著性上调lovo拓扑异构酶ImRNA的表达,两组间的差异有统计学意义(P=0.031)(如图9所示)。六、作用24小时,5μg/ml处理组与阴性对照组相比,5μg/ml处理组显著性上调拓扑异构酶Ⅰ蛋白的表达,两组间的差异有统计学意义(P=0.011),但10μg/ml处理组与阴性对照组比较,两组间拓扑异构酶Ⅰ蛋白表达的差异无统计学意义(P=0.384)；作用48小时,与阴性对照组相比,5μg/ml处理组中拓扑异构酶Ⅰ蛋白的表达显著性下降,两组间的差异有统计学差异(P=0.006),但10μg/ml处理组中显著性上调lovo拓扑异构酶Ⅰ蛋白的表达,两组间的差异有统计学意义(P=0.001)(如图10所示)。结论：1、姜黄素、伊立替康单药均可抑制lovo细胞增殖的作用,其抑制作用效果随着时间和剂量的增加而增强。2、不同浓度姜黄素、伊立替康联合作用于lovo细胞,姜黄素可以增强伊立替康对lovo细胞的杀伤作用,两者对lovo细胞的抑制效应具有协同作用；贯序给药法比混合给药法更有效提高姜黄素联合伊立替康对lovo细胞的杀伤作用。3、姜黄素可以上调lovo细胞拓扑异构酶Ⅰ mRNA及蛋白表达,有可能增加伊立替康对lovo细胞的作用靶点而增强伊立替康对lovo细胞的杀伤作用。