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奶牛乳房炎是奶牛养殖行业持续高发的严重疾病,影响奶牛的健康、生乳品质及产业效率和效益。在实际生产中,亚临床乳房炎（Subclinical Mastitis,SM）的发病率往往高于临床乳房炎（Clinical Mastitis,CM）,因其临床症状不明显,隐蔽性强,潜伏期长,极易造成大范围感染。近来的研究表明,乳房炎的发生及发展与宿主胃肠道菌群结构紊乱有关。菊粉是一种公认的益生元产品,在人类和动物的研究中均显示出优化肠道菌群结构和提高宿主免疫能力的特性。因此,在乳房炎早期阶段（即,SM）通过营养调控的手段能否实现对乳房炎发病的缓解是值得关注和研究的方向。本研究靶向胃肠道菌群及代谢物结构,拟探究菊粉补充对SM的影响及机理。首先通过对比健康与乳房炎奶牛乳和胃肠道（瘤胃和粪便）菌群及代谢物结构差异,初步揭示乳房炎奶牛胃肠道菌群及代谢物结构特征,及其与乳房炎症之间的相关性;进而探究菊粉补充对SM炎症症状的影响及其调控机制。本研究拟从胃肠道菌群结构的角度初步揭示乳房炎发病特征,并试图通过营养调控手段为乳房炎发病早期提供可行的缓解措施。试验1健康、SM及CM奶牛泌乳性能及乳中菌群与代谢物结构差异研究乳腺内菌群及代谢物结构与奶牛乳房炎发病密切相关。本试验旨在明晰健康（healthy,H）、SM和CM奶牛乳中微生物多样性和代谢物的差异。根据乳体细胞数（Somatic cell counts,SCC）,差异体细胞计数（Differential somatic cell counts,DSCC）加州乳房炎检测（California mastitis test,CMT）结果及乳房临床症状,筛选出H、SM及CM奶牛各20头。采用16S r RNA测序和非靶向代谢组学技术对上述3类乳样本进行菌群及代谢物结构的检测。结果表明:1)随着乳房炎程度的加剧,产奶量（P=0.021）、乳脂（P=0.036）和乳糖（P＜0.01）显著降低,而乳SCC显著升高（P＜0.01）。乳脂肪酸中,C4（P=0.04）、C16:1（P=0.03）、C18:3n6（P=0.03）和C18:1c9（P=0.02）等,而C14:1（P=0.02）、C18:1t9（P=0.02）和C18:2t6（P＜0.01）显著增加。2)厚壁菌门（Firmicutes;P=0.038）在CM组中显著富集,放线菌门（Actinobacteria;P=0.002）、拟杆菌门（Bacteroidetes;P=0.002）及螺旋体门（Spirochaetes;P=0.029）在SM组显著富集。微生物组和代谢组联合分析表明,CM组乳中葡萄球菌（Staphylococcus）、链球菌（Streptococcus）与神经酰胺存在正相关关系。SM组乳中,不动杆菌（Acinetobacter）和棒状杆菌（Corynebacterium）与睾酮葡萄糖醛酸和5-甲基四氢叶酸呈正相关。乳房炎奶牛乳中的有益共生菌,如迪茨氏菌属（Dietzia）、气微菌属（Aeromicrobium）、另枝菌属（Alistipes）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）等,及参与嘌呤、维生素及氨基酸代谢的化合物丰度显著降低。本试验结果表明,乳房炎奶牛乳中潜在致病菌与炎症相关代谢产物富集,而共生菌和参与维持正常生理代谢的化合物丰度减少。试验2健康、SM及CM奶牛胃肠道菌群及代谢物结构差异研究近来的研究表明,胃肠道菌群结构与乳房炎的发生及发展紧密相关。因此,在试验一的基础上,本试验进一步比较了不同乳房健康状况奶牛瘤胃及粪便微生物及代谢物结构特征。结果表明:1)随着乳房炎程度的增加,瘤胃中乳酸（lactic acid,LA）（P＜0.01）、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸（P＜0.001）和总挥发性脂肪酸（total volatile fatty acids,TVFA）（P＜0.01）浓度显著降低。瘤胃菌群多样性在SM和CM奶牛中显著降低。CM奶牛的瘤胃中,与肠道和口腔炎症相关的细菌显著增加,如莫拉氏菌（Moraxella）（FDR校正P=0.011）和奈瑟菌科（Neisseriaceae）（FDR校正P=0.036）等。同时,促炎代谢产物,如12-氧代-20-二羟基白三烯B4（FDR校正P=5.97×10-9）和10β-羟基-6β-异丁基呋喃亚甲基（FDR校正P=3.88×10-10）的水平增加。在SM奶牛的瘤胃中,瘤胃梭菌＿9（Ruminiclostridium＿9）（FDR校正P=0.042）和肠杆菌（Enterorhabdus）（FDR校正P=0.043）的增加伴随着六亚甲基四胺（FDR校正P=6.95×10-6）,5-羟甲基-2-呋喃甲醛（FDR校正P=2.02×10-6）及6-甲氧基蜂毒毒素（FDR校正P=2.57×10-5）丰度的增加。然而,瘤胃中短链脂肪酸（short-chain fatty acids,SCFA）产生菌及部分益生菌,包括普氏杆菌＿1（Prevoterotoella＿1）（FDR校正P=0.045）和双歧杆菌（Bifidobacterium）（FDR校正P=0.035）,及2-苯基丁酸（FDR校正P=4.37×10-6）丰度随着乳房炎加剧而显著减少。2)与H组奶牛相比,SM奶牛和CM奶牛粪便菌群多样性较低。CM奶牛粪便中Bifidobacterium（FDR校正P=0.035）、罗姆布茨菌（Romboutsia）（FDR校正P=0.040）、毛螺菌科＿NK3A20＿group（Lachnospiraceae＿NK3A20＿group）（FDR校正P=0.046）、粪球菌属（Coprococcus）（FDR校正P=0.045）、普雷沃氏菌科＿UCG-003（Prevotellaceae＿UCG-003）（FDR校正P=0.046）及另枝菌属（Alistipes）（FDR校正P=0.042）丰度较低,而变形杆菌门（Proteobacteria）（FDR校正P=0.040）和大肠杆菌属（Escherichia-Shigellawas）（FDR校正P=0.043）丰度较高。SM奶牛粪便中克雷伯氏菌（Klebsiella）（FDR校正P=0.044）显著富集。粪便和血清代谢物存在相似之处,即促炎脂质产物丰度较高,而参与次级胆汁酸（Secondary bile acids,SBAs）、能量及嘌呤代谢的化合物丰度较低。3)SM和CM奶牛血清中IL-1β（P=0.038）、IL-6（P=0.022）、TNF-α（P=0.046）、甘油三酯（triglyceride,TG）（P=0.026）及总胆固醇（total cholesterol,TC）（P=0.039）浓度升高。高密度脂蛋白（high-density lipoprotein,HDL）（P=0.041）浓度降低。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）浓度在乳房炎奶牛血清、瘤胃及粪便中均有增加。本研究表明,不同乳腺健康状况的奶牛胃肠道菌群和代谢物结构存在显著差异,一些潜在致病菌及促炎代谢产物在乳房炎奶牛胃肠道内富集,同时乳房炎发病期间伴随着氧化应激和血脂水平异常。试验3菊粉补充对SM奶牛泌乳性能、瘤胃及粪便发酵参数及血液炎症因子表达的影响本试验通过体外与体内试验结合,初步探究菊粉对SM奶牛生理生产性能及炎症反应的影响。体外试验设置8个菊粉添加水平0.0（对照）、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%和1.4%。每个菊粉添加水平设9个培养瓶（3个重复×3个培养时间）,3个培养时间（24、48和72 h）。选择4头健康泌乳中期荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体。结果表明,产气量（P=0.03）在0.8%菊粉组中显著增加,丙酸（P=0.03）、丁酸（P=0.04）和总挥发性脂肪酸（P=0.02）在0.8%和1.0%菊粉组中显著增加,而NH3-N浓度（P=0.02）及乙酸与丙酸的比值（A/P;P=0.04）在0.8%和1.0%菊粉组中最低。微生物蛋白浓度（P=0.03）在0.8%、1.0%和1.2%菊粉组中显著增加。单因素关联效应指数和多因素关联效应指数计算结果表明,0.8%菊粉添加量的培养效果最佳。根据体外试验结果,体内试验选择体况相近的40头SM奶牛,菊粉添加水平分别为0（对照）、100、200、300和400 g/天/头,试验共8周。结果表明,1)与对照组相比,300 g/天/头菊粉组产奶量（P=0.031）、乳蛋白（P=0.034）及乳糖率（P=0.027）增加,乳SCC显著降低（P＜0.01）。此外,乳中的饱和脂肪酸,C4（P=0.032）、C11（P=0.044）、C13（P=0.041）、C15（P=0.022）、antiisoc15:0（P=0.041）、antiisoc17:0（P=0.021）和iso C17:0（P=0.035）比例在300 g/天/头菊粉组中均增加,而不饱和脂肪酸比例（P=0.062）呈下降趋势,其中C20:1（P=0.087）、C18:2n6c（P=0.093）、C18:3n3（P=0.081）以及所有长链脂肪酸（P=0.063）的比例随着菊粉的补充均呈下降趋势。2)在瘤胃及粪便中,菊粉补充增加了丙酸（P=0.021;P=0.041）、丁酸（P=0.034;P=0.047）及总挥发酸（P=0.041;P=0.058）浓度,降低了乙丙比（P=0.041;P=0.061）,p H值（P=0.083;P=0.086）呈下降趋势。3)菊粉补充增加了SM奶牛血清中IL-4（P=0.042）浓度,降低了Ig G（P=0.013）、IL-6（P=0.035）、IL-8（P=0.034）、TNF-α（P=0.042）、TC（P=0.042）、TG（P=0.037）和低密度脂蛋白（LDL）（P=0.020）浓度。此外,菊粉补充降低了瘤胃液（P=0.040）及血清（P=0.045）LPS浓度,粪便样品中LPS浓度无显著变化。本试验结果表明,菊粉补充改善了SM奶牛泌乳性能,提高了瘤胃及粪便中丙酸与丁酸浓度,降低了乳SCC及促炎因子表达水平,且上述指标以300 g/天/头菊粉补充剂量效果最佳。试验4菊粉补充调控奶牛SM炎症反应的机理本试验在试验3的基础上进一步探究菊粉补充对SM奶牛胃肠道及乳中菌群与代谢物结构及血液代谢物与血脂水平的影响,以阐释菊粉对SM炎症反应的调控机制。结果表明:1)在瘤胃和粪便中,补充菊粉（300g/天/头）增加了Bacteroidota（FDR校正P=0.033;FDR校正的P=0.048）丰度,降低了Firmicutes（FDR校正P=0.037;FDR校正P=0.047）丰度。在属水平上,丙酸和丁酸产生菌（如Bifidobacterium（FDR校正P=0.043;FDR校正P=0.032）和Lachnospiraceae＿NK3A20＿group（FDR校正P=0.046;FDR校正P=0.034）;瘤胃中Alistipes（FDR校正P=0.046）及unclassified＿o＿＿Bacteroidales（FDR校正P=0.040））的相对丰度增加。一些促炎微生物（如瘤胃中Clostridia＿UCG-014（FDR校正P=0.035）、Streptococcus（FDR校正P=0.048）、Staphylococcus（FDR校正P=0.045）、Neisseriaceae（FDR校正P=0.046）和Escherichia-Shigella（FDR校正P=0.045）丰度降低;粪便中Paeniclostridium（FDR校正P=0.034）、unclassified＿c＿＿Clostridia（FDR校正P=0.034）和unclassified＿f＿＿Peptostreptococcaceae（FDR校正P=0.040）丰度减少。同时,瘤胃中参与能量和氨基酸代谢的化合物（如蜜二糖（FDR校正P=0.006;FDR校正P=0.003）和L-谷氨酸（FDR校正P=0.017;FDR校正P=0.046）等）水平增加。粪便和血清中SBAs代谢物（去氧胆酸（FDR校正P=0.006）、牛磺去氧胆酸（FDR校正的P=0.040）和粪甾烷酸（FDR校正P=0.032））水平升高。脂质促炎代谢物（如神经酰胺（d18:0/13:0）（FDR校正P=0.010）和12-oxo-20-二羟基白三烯B4（FDR校正P=0.046）等）水平在瘤胃和粪便中均有所降低。2）菊粉（300g/天/头）补充增加了SM奶牛乳中益生菌（如Lactobacillus（FDR校正P=0.044）、Bifidobacterium（FDR校正P=0.026））丰度,降低了乳房炎致病菌和潜在促炎菌（如Escherichia-Shigella（FDR校正P=0.045）、Pseudomonas（FDR校正P=0.038）、Rhodococcus（FDR校正P=0.031）及Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（FDR校正P=0.037）等）丰度。同时,花生四烯酸类促炎介质(白三烯E3(FDR校正P=4.52×10-5)、20-羧基-白三烯B4(FDR校正P=5.59×10-5)、12-Oxo-c-白三烯B3（FDR校正P=0.001）)和磷脂代谢物水平降低,而参与能量代谢（柠檬酸（FDR校正P=0.002）、L-肉碱（FDR校正P=0.001）等）等化合物丰度有所增加。本试验结果表明,菊粉补充促进了SM奶牛胃肠道及乳中丙酸及丁酸产生菌和有益共生菌的增殖,增加了参与能量、嘌呤、氨基酸及SBAs代谢的化合物水平,抑制了潜在致病菌的生长和脂质促炎代谢产物的丰度。血脂水平的降低与丙酸和SBAs代谢物的增加有关。本试验发现,菊粉调控的菌群与代谢物种类与试验1和2鉴定到的部分差异菌群与代谢物种类相同,说明菊粉能够对部分SM特异性菌群及代谢物进行靶向调控。综上所述,本研究表明,CM与SM奶牛胃肠道（瘤胃和粪便）及乳中菌群与代谢物结构较健康奶牛差异显著,主要表现是潜在致病菌与促炎代谢产物在乳房炎奶牛瘤胃、粪便及乳中富集,而胃肠道中有益共生菌及参与维持正常生理代谢的化合物及短链脂肪酸浓度降低。乳房炎期间,血脂水平异常主要表现为TC和TG浓度升高。给SM奶牛补充菊粉可增加胃肠道丙酸和丁酸产生菌及某些益生菌丰度,提高胃肠道丙酸和丁酸浓度,抑制一些潜在的促炎及致病微生物;补充菊粉提高了胃肠道参与能量、氨基酸及SBAs代谢的代谢物水平,降低了促炎脂质代谢物水平;补充菊粉降低了血清中的炎性细胞因子及TG和TC水平,这可能与丙酸和SBAs代谢物的增加有关。胃肠道内环境的改善进一步影响了乳腺内环境。因此,菊粉补充后SM奶牛乳中益共生菌增加,致病菌、促炎代谢产物及SCC减少,产奶量、乳蛋白及乳糖率改善。