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目的:
阿奇霉素是临床常用的大环内酯类抗菌药,不良反应相对较少。但近几年,有越来越多的证据表明阿奇霉素可能增加心血管死亡风险,尤其是心律失常的发生。纵观大量文献报道,未见有对其在动物水平上的致心律失常的机制研究。为了验证这一风险存在的真实性,降低临床用药的不良反应发生率,所以对此药进行了一系列基础的心脏安全性评价实验。
药物与试剂马来酸阿奇霉素注射液(津博),规格0.25g,从南京市仙林鼓楼医院购买,生产批号081406026,国药准字H20020293,生产厂家:天津生物化学制药有限公司。其他化学试剂大部分购自Si舯a公司,小部分购自国产代理商。
动物
豚鼠,质量250~350g,雄性,由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。实验动物生产许可证:SCXK(沪)2013-0006。
方法:
1.豚鼠在体心电图记录:
20%乌拉坦(5mL/kg)对豚鼠进行腹腔麻醉,以仰卧位进行固定,分出一侧颈静脉,进行插管,再给药。四肢皮下扎入针形电极引导记录Ⅱ导联心电信号,经四道生理记录仪采样并存入计算机。于静脉推注药物5min后记录心电图,分析心率(HR)、P-R间期、QRS间期和QTc间期。
按照阿奇霉素注射液说明书规定的:成人用量为每人每天500mg(静脉滴注),在体实验采用500mg为1倍临床剂量,即8.3mg/kg.(按成人60kg计算)。人体与动物用药量按体表面积系数计算,以每公斤体重进行比较。国际标准:豚鼠的剂量为人用剂量的4.6倍,基于这种换算原则,豚鼠在体一倍剂量为38.2mg/kg,依次类推。
2.豚鼠离体心电图记录:
20%乌拉坦(5mL/kg)对豚鼠腹腔注射麻醉,固定后迅速开胸取出心脏,置于0℃的无钙灌流液中。应用改进的Langendorff装置灌流系统,经主动脉进行离体心脏灌流,心脏复跳后在心外膜下置3根银丝电极:正极置于心尖处,负极置于右心房,接地电极置于主动脉根部,引导出离体心脏心电图。待豚鼠心脏跳动稳定后,信号经四道生理记录仪输入计算机记录,分析心率(HR)、P-R间期、QRS间期和QTc间期。
按照阿奇霉素注射液说明书规定的:成人用量为每人每天500mg(静脉滴注),即8.3mg/kg(按成人60kg计算)。成人细胞外液约占体重的20%,那么换算成临床血药浓度即为41.5mg/L,据上述方法换算后,离体实验的组织和细胞灌流液1倍临床浓度为41.5mg/L。豚鼠的离体心脏心电图实验按照1,5,10倍的临床浓度给药,每一浓度的灌流液体积为20mL,灌流速度约2~3mL/min。
3.豚鼠左心室乳头肌动作电位记录:
用20%乌拉坦(5mL/kg)对豚鼠进行腹腔麻醉,快速开胸取出心脏,置于0~4℃无钙台氏液中停止搏动,剪下左心室乳头肌,将其固定于恒温(35.5~36.5℃)水浴槽底部。恒温恒速条件下用含钙台氏液灌流,稳定30min后进行实验。刺激频率1Hz,波宽10ms,强度1.5倍阈值的方波刺激。信号经放大器、数模转换器显示于电脑屏幕并记录在计算机内部,分析动作电位复极50%(APD50)及90%(APD90)水平的时程。
4.豚鼠左心室单个肌细胞动作电位记录:
用改良后的酶解法分离豚鼠单个心室肌细胞。健康豚鼠,雄性,250~300g。腹腔注射20%乌拉坦(5mL/kg),在100%氧饱和的0℃无钙台氏液中清洗修剪,并将其固定在改良的Langendorff心脏灌流装置上,在37℃的恒温,充氧(95%O2+5%CO2)条件下,用无钙灌流液持续逆向灌流,使心脏先复跳后停跳,再用含消化酶(Collage-naseⅡ2mg/mL,胰蛋白酶0.1mg/mL)的无钙灌流液反复灌流40min,至心脏膨大、松弛,最后再用适量KB液灌流冲洗。取下心脏,将消化后的左心室肌组织块置于盛有KB液的玻璃皿中充分剪碎,用直径200μm的尼龙网过滤,将细胞悬液导入离心管中,静置,KB液洗三次。最后置于室温下备用。
无钙灌流液的组成(mM):NaCl135,KCl5.4,NaH2PO40.33,MgCl21,HEPES5,Glucose10,pH用NaOH调至7.4。KB液组成(mM):KCl25,NaH2PO410,L-谷氨酸70,Taurine10,EGTA0.5,HEPES20,Glucose11,KOH85,pH用KOH调至7.4。
采用膜片钳全细胞电流钳记录方法,在室温(22~25℃)下进行。将细胞悬液数滴加入倒置显微镜上的灌流槽中,待细胞稳定后,用细胞外液灌流。其组成为(mM):NaCl117,KCl5.7,NaHCO34.4,MgCl21.7,旺PES20,Glucose20,Taurjne20,CaCl21.8,用NaOH调节pH至7.3。选取杆状,横纹清晰,表面无颗粒,无收缩的细胞进行封接实验。玻璃毛细管经微电极拉制仪两步拉制成尖端直径约为1μm的电极,电极充灌内液后入水阻抗约2~5MΩ,电极内液组成(mM):KCl135,EGTA10,Glucose5,HEPES10,Na2-ATP3,Na-GTP0.5,pH用KOH调至7.1。调节三维操纵器使电极尖端移向细胞表面进行封接。在电压钳模式下测电阻,当封接电阻达到1GΩ以上后补充快电容,并给予负压破膜形成全细胞记录模式。在电流钳模式下记录动作电位,电信号由膜片钳放大器放大,再经数模转换器转换与计算机对接,在电脑屏幕上显示出电变化,信号的发放、采集与数据分析均由Clampfit10.4(Axon Instruments,USA)软件完成,并将数据存储于电脑硬盘,分析动作电位复极50%(APD50)及90%(APD9+0)水平的时程。
结果:
1.阿奇霉素注射液对豚鼠在体心脏心电图的影响:
结果显示:阿奇霉素注射液1,3,5倍临床剂量,既38.2mg/kg→114.6mg/kg→19lmg/kg按顺序累计静脉推注,AXM38.2mg/kg略微改变豚鼠在体心电图各参数,未有显著性差异:AZM114.6mg/蚝明显改变豚鼠在体心电图各参数,并且AZM114.6mg瓜g药物组与对照组和AZM38.2mg/kg药物组相比,具有显著性差异。AZM114.6mg/kg能够显著降低心率,延长P-R间期和QTc间期,增大QRS波宽,降低QRS波和P波幅度;AZM191mg/kg,显著降低心率,QRS波宽大变形,P波、T波消失。
2.阿奇霉素注射液对豚鼠离体心脏心电图的影响:
结果显示:阿奇霉素注射液1,5,10倍临床浓度,按照41.5mg/L→207.5mg/L→415mg/L→Wash out的顺序依次灌流,AZM41.5mg/L明显降低心率,与对照组相比有显著性差异;AZM207.5mg/L和AZM415mg/L明显降低心率,延长P-R和QTc间期,增大QRS波宽,其中HR、P-R、QRS三指标变化与对照组及低剂量组形成显著性差异,QTc只与对照组形成显著性差异;含钙灌流液洗脱后,各指标部分恢复。
3.阿奇霉素注射液对豚鼠左心室乳头肌动作电位的影响:
不同浓度的AZM能够不同程度的延长单个心肌细胞的动作电位时程(APD),且有一定的浓度依赖性;各浓度药物组与对照组的APD50和APD90相比较,AZM830mg/L(20倍临床浓度)组与对照组和AZM41.5mg/L(1倍临床浓度)组有显著性差异,而AZM415mg/L(10倍临床浓度)组与对照组也形成显著性差异。
4.阿奇霉素注射液对豚鼠单个心室肌细胞动作电位的影响:
不同浓度的删能够不同程度的延长单个心肌细胞的动作电位时程(APD),且有一定的浓度依赖性;各浓度药物组与对照组的APD50和APD90相比较,只有AZM830mg/L(20倍临床浓度)组与对照组和AZM41.5mg/L(1倍临床浓度)组有显著性差异。
结论:
1.通过豚鼠在体ECG和离体ECG实验,能够初步证明阿奇霉素注射液的确能够造成心动过缓,稳定诱发缓慢型心律失常。
2.组织块和单细胞动作电位实验表明,丸粥明显延长APD50和APD90,使心脏复极延迟,进一步验证了AZM的致心律失常作用。
3.离子通道实验,阿奇霉素能够不同程度阻滞L型钙通道、钠通道、快速延迟整流钾电流通道,但AZM对ICa-L、INa抑制程度远大于IKr,AZM浓度由低到高的过程,抑制ICa-L、INa先于IKr,这与心电图实验结果相吻合。揭示AZM能诱导正常豚鼠发生房室传导阻滞和心室内传导阻滞,这可能与其明显抑制钠、钙通道有关。
阿奇霉素是临床常用的大环内酯类抗菌药,不良反应相对较少。但近几年,有越来越多的证据表明阿奇霉素可能增加心血管死亡风险,尤其是心律失常的发生。纵观大量文献报道,未见有对其在动物水平上的致心律失常的机制研究。为了验证这一风险存在的真实性,降低临床用药的不良反应发生率,所以对此药进行了一系列基础的心脏安全性评价实验。
药物与试剂马来酸阿奇霉素注射液(津博),规格0.25g,从南京市仙林鼓楼医院购买,生产批号081406026,国药准字H20020293,生产厂家:天津生物化学制药有限公司。其他化学试剂大部分购自Si舯a公司,小部分购自国产代理商。
动物
豚鼠,质量250~350g,雄性,由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。实验动物生产许可证:SCXK(沪)2013-0006。
方法:
1.豚鼠在体心电图记录:
20%乌拉坦(5mL/kg)对豚鼠进行腹腔麻醉,以仰卧位进行固定,分出一侧颈静脉,进行插管,再给药。四肢皮下扎入针形电极引导记录Ⅱ导联心电信号,经四道生理记录仪采样并存入计算机。于静脉推注药物5min后记录心电图,分析心率(HR)、P-R间期、QRS间期和QTc间期。
按照阿奇霉素注射液说明书规定的:成人用量为每人每天500mg(静脉滴注),在体实验采用500mg为1倍临床剂量,即8.3mg/kg.(按成人60kg计算)。人体与动物用药量按体表面积系数计算,以每公斤体重进行比较。国际标准:豚鼠的剂量为人用剂量的4.6倍,基于这种换算原则,豚鼠在体一倍剂量为38.2mg/kg,依次类推。
2.豚鼠离体心电图记录:
20%乌拉坦(5mL/kg)对豚鼠腹腔注射麻醉,固定后迅速开胸取出心脏,置于0℃的无钙灌流液中。应用改进的Langendorff装置灌流系统,经主动脉进行离体心脏灌流,心脏复跳后在心外膜下置3根银丝电极:正极置于心尖处,负极置于右心房,接地电极置于主动脉根部,引导出离体心脏心电图。待豚鼠心脏跳动稳定后,信号经四道生理记录仪输入计算机记录,分析心率(HR)、P-R间期、QRS间期和QTc间期。
按照阿奇霉素注射液说明书规定的:成人用量为每人每天500mg(静脉滴注),即8.3mg/kg(按成人60kg计算)。成人细胞外液约占体重的20%,那么换算成临床血药浓度即为41.5mg/L,据上述方法换算后,离体实验的组织和细胞灌流液1倍临床浓度为41.5mg/L。豚鼠的离体心脏心电图实验按照1,5,10倍的临床浓度给药,每一浓度的灌流液体积为20mL,灌流速度约2~3mL/min。
3.豚鼠左心室乳头肌动作电位记录:
用20%乌拉坦(5mL/kg)对豚鼠进行腹腔麻醉,快速开胸取出心脏,置于0~4℃无钙台氏液中停止搏动,剪下左心室乳头肌,将其固定于恒温(35.5~36.5℃)水浴槽底部。恒温恒速条件下用含钙台氏液灌流,稳定30min后进行实验。刺激频率1Hz,波宽10ms,强度1.5倍阈值的方波刺激。信号经放大器、数模转换器显示于电脑屏幕并记录在计算机内部,分析动作电位复极50%(APD50)及90%(APD90)水平的时程。
4.豚鼠左心室单个肌细胞动作电位记录:
用改良后的酶解法分离豚鼠单个心室肌细胞。健康豚鼠,雄性,250~300g。腹腔注射20%乌拉坦(5mL/kg),在100%氧饱和的0℃无钙台氏液中清洗修剪,并将其固定在改良的Langendorff心脏灌流装置上,在37℃的恒温,充氧(95%O2+5%CO2)条件下,用无钙灌流液持续逆向灌流,使心脏先复跳后停跳,再用含消化酶(Collage-naseⅡ2mg/mL,胰蛋白酶0.1mg/mL)的无钙灌流液反复灌流40min,至心脏膨大、松弛,最后再用适量KB液灌流冲洗。取下心脏,将消化后的左心室肌组织块置于盛有KB液的玻璃皿中充分剪碎,用直径200μm的尼龙网过滤,将细胞悬液导入离心管中,静置,KB液洗三次。最后置于室温下备用。
无钙灌流液的组成(mM):NaCl135,KCl5.4,NaH2PO40.33,MgCl21,HEPES5,Glucose10,pH用NaOH调至7.4。KB液组成(mM):KCl25,NaH2PO410,L-谷氨酸70,Taurine10,EGTA0.5,HEPES20,Glucose11,KOH85,pH用KOH调至7.4。
采用膜片钳全细胞电流钳记录方法,在室温(22~25℃)下进行。将细胞悬液数滴加入倒置显微镜上的灌流槽中,待细胞稳定后,用细胞外液灌流。其组成为(mM):NaCl117,KCl5.7,NaHCO34.4,MgCl21.7,旺PES20,Glucose20,Taurjne20,CaCl21.8,用NaOH调节pH至7.3。选取杆状,横纹清晰,表面无颗粒,无收缩的细胞进行封接实验。玻璃毛细管经微电极拉制仪两步拉制成尖端直径约为1μm的电极,电极充灌内液后入水阻抗约2~5MΩ,电极内液组成(mM):KCl135,EGTA10,Glucose5,HEPES10,Na2-ATP3,Na-GTP0.5,pH用KOH调至7.1。调节三维操纵器使电极尖端移向细胞表面进行封接。在电压钳模式下测电阻,当封接电阻达到1GΩ以上后补充快电容,并给予负压破膜形成全细胞记录模式。在电流钳模式下记录动作电位,电信号由膜片钳放大器放大,再经数模转换器转换与计算机对接,在电脑屏幕上显示出电变化,信号的发放、采集与数据分析均由Clampfit10.4(Axon Instruments,USA)软件完成,并将数据存储于电脑硬盘,分析动作电位复极50%(APD50)及90%(APD9+0)水平的时程。
结果:
1.阿奇霉素注射液对豚鼠在体心脏心电图的影响:
结果显示:阿奇霉素注射液1,3,5倍临床剂量,既38.2mg/kg→114.6mg/kg→19lmg/kg按顺序累计静脉推注,AXM38.2mg/kg略微改变豚鼠在体心电图各参数,未有显著性差异:AZM114.6mg/蚝明显改变豚鼠在体心电图各参数,并且AZM114.6mg瓜g药物组与对照组和AZM38.2mg/kg药物组相比,具有显著性差异。AZM114.6mg/kg能够显著降低心率,延长P-R间期和QTc间期,增大QRS波宽,降低QRS波和P波幅度;AZM191mg/kg,显著降低心率,QRS波宽大变形,P波、T波消失。
2.阿奇霉素注射液对豚鼠离体心脏心电图的影响:
结果显示:阿奇霉素注射液1,5,10倍临床浓度,按照41.5mg/L→207.5mg/L→415mg/L→Wash out的顺序依次灌流,AZM41.5mg/L明显降低心率,与对照组相比有显著性差异;AZM207.5mg/L和AZM415mg/L明显降低心率,延长P-R和QTc间期,增大QRS波宽,其中HR、P-R、QRS三指标变化与对照组及低剂量组形成显著性差异,QTc只与对照组形成显著性差异;含钙灌流液洗脱后,各指标部分恢复。
3.阿奇霉素注射液对豚鼠左心室乳头肌动作电位的影响:
不同浓度的AZM能够不同程度的延长单个心肌细胞的动作电位时程(APD),且有一定的浓度依赖性;各浓度药物组与对照组的APD50和APD90相比较,AZM830mg/L(20倍临床浓度)组与对照组和AZM41.5mg/L(1倍临床浓度)组有显著性差异,而AZM415mg/L(10倍临床浓度)组与对照组也形成显著性差异。
4.阿奇霉素注射液对豚鼠单个心室肌细胞动作电位的影响:
不同浓度的删能够不同程度的延长单个心肌细胞的动作电位时程(APD),且有一定的浓度依赖性;各浓度药物组与对照组的APD50和APD90相比较,只有AZM830mg/L(20倍临床浓度)组与对照组和AZM41.5mg/L(1倍临床浓度)组有显著性差异。
结论:
1.通过豚鼠在体ECG和离体ECG实验,能够初步证明阿奇霉素注射液的确能够造成心动过缓,稳定诱发缓慢型心律失常。
2.组织块和单细胞动作电位实验表明,丸粥明显延长APD50和APD90,使心脏复极延迟,进一步验证了AZM的致心律失常作用。
3.离子通道实验,阿奇霉素能够不同程度阻滞L型钙通道、钠通道、快速延迟整流钾电流通道,但AZM对ICa-L、INa抑制程度远大于IKr,AZM浓度由低到高的过程,抑制ICa-L、INa先于IKr,这与心电图实验结果相吻合。揭示AZM能诱导正常豚鼠发生房室传导阻滞和心室内传导阻滞,这可能与其明显抑制钠、钙通道有关。