基于磁性纳米材料的免标记电化学生物传感器的构建及对CYP2C9*3基因和VEGF165蛋白的检测

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近年来,精准医疗和疾病的早期检测备受人们的关注,生物样本的检测需求也急剧增加。但生物样本检测成分通常浓度较低,传统的检测手段往往耗时且操作复杂,因此急需开发出更方便快捷的新型检测手段。电化学生物传感器操作简便、快速、灵敏度高,可克服传统检测手段的不足,实现对复杂样本的快速检测。纳米材料的电子转移效率高,可将纳米材料与电化学传感器相结合构建灵敏度更高的传感器用于生物样本的检测。因此,本文分别用磁性Fe3O4/Fe2O3@Au纳米棒和纳米颗粒作为信号放大介质,将磁性纳米材料与磁力诱导自组装技术相结合,以CYP2C9*3基因和VEGF165蛋白为检测对象构建两种电化学核酸传感器,并对其检测性能进行了评价。主要研究成果如下:(1)磁性Fe3O4/Fe2O3@Au纳米棒的制备:以Fe Cl3·6H2O为原料,采用加热水解-燃烧煅烧法制备了磁性Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒,并对Fe3+浓度、水解时间、水解温度、无水乙醇用量、煅烧温度以及煅烧时间进行条件优化,最优条件为0.1M Fe Cl3在90℃水解2 h,50 m L无水乙醇300℃煅烧2 h。最优条件下得到的磁性Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒平均长度约为199 nm,平均直径约为51 nm,饱和磁化强度为13 emu·g-1,Zeta电位为+17.2 m V。采用柠檬酸三钠还原法对异质体纳米棒进行表面修饰,得到磁性Fe3O4/Fe2O3@Au纳米棒,平均长度约为210 nm,平均直径约为57 nm,金壳厚度约为9 nm,饱和磁化强度为7 emu·g-1,Zeta电位为-8.9m V。(2)磁性Fe3O4/Fe2O3@Au纳米颗粒的制备:以Fe(NO3)3·9H2O为原料,采用加热水解-燃烧煅烧法制备了磁性Fe3O4/Fe2O3异质体纳米颗粒,并考察了水解时间、水解温度、Fe3+浓度、无水乙醇体积、煅烧时间以及煅烧温度对磁性Fe3O4/Fe2O3异质体纳米颗粒性能的作用,最优制备条件为0.05 M Fe(NO3)3在90℃水解8 h,20 m L无水乙醇200℃煅烧2 h。最优条件下制备的磁性Fe3O4/Fe2O3异质体纳米颗粒平均直径约为46 nm,饱和磁化强度为54 emu·g-1,流体动力学直径为139 nm,Zeta电位为+25.8 m V。采用柠檬酸三钠还原法成功制备磁性Fe3O4/Fe2O3@Au纳米颗粒,整体直径约为96 nm,饱和磁化强度为43 emu·g-1,流体动力学直径为363 nm,Zeta电位为-19.2 m V。(3)基于磁性Fe3O4/Fe2O3@Au纳米棒的磁诱导自组装免标记电化学生物传感器的构建及CYP2C9*3基因检测:将磁性Fe3O4/Fe2O3@Au纳米棒通过磁场自组装至电极表面,巯基改性的肽核酸(PNA)利用Au-S键连接至纳米棒金壳的表面,PNA与DNA通过碱基互补配对原则进行杂交,从而实现CYP2C9*3基因的特异性检测,具有良好的选择性。采用差分脉冲伏安法(DPV)对Fe3O4/Fe2O3@Au纳米棒浓度、PNA浓度、杂交温度和杂交时间进行优化,最佳检测条件为Fe3O4/Fe2O3@Au纳米棒浓度为15 mg·m L-1,PNA浓度为1.6μM,杂交温度为70℃,杂交时间为30 min。在最优条件下,生物传感器的线性范围为1 p M-1μM(R~2=0.9941),检测限(LOD)为0.95 p M,定量限(LOQ)为3.18 p M。5个电极峰值电流的标准偏差系数(RSD)仅为2.6%,具有优越的再现性。且该传感器可在4℃稳定储存15天,其DPV信号仍有原来的82.2%,具有良好的稳定性。(4)基于磁性Fe3O4/Fe2O3@Au纳米颗粒的磁诱导自组装免标记电化学生物传感器的构建及VEGF165肿瘤标志物检测:将磁性Fe3O4/Fe2O3@Au纳米颗粒通过磁场自组装至电极表面,巯基修饰的DNA适配体通过Au-S键连接至纳米颗粒表面,DNA适配体可特异性识别VEGF165蛋白,从而实现对VEGF165肿瘤标志物的特异性检测。采用DPV对Fe3O4/Fe2O3@Au纳米颗粒浓度、DNA适配体浓度、孵育温度和孵育时间进行优化,最佳检测条件为Fe3O4/Fe2O3@Au纳米颗粒浓度为15mg·m L-1,DNA适配体浓度为1.2μM,孵育温度为37℃,孵育时间为40 min。在最优条件下,电化学传感器线性范围为0.01-10 pg·m L-1(R~2=0.9973),LOD为0.01 pg·m L-1,LOQ为0.03 pg·m L-1。与干扰物质相比,VEGF165蛋白电信号强度仅为其余干扰物质的35.2%,具有良好的选择性。5个不同电极DPV信号的RSD仅为3.7%,具有良好的再现性。该传感器在4℃冰箱中存放15天后,其电信号仍有原来的86.7%,具有良好的稳定性。
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