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恶性黑色素瘤是人类皮肤肿瘤中恶性程度最高的肿瘤之一,其死亡率占皮肤肿瘤患者的80%,且恶性黑色素瘤极易恶化,对化疗药物具有较强的耐药性,本课题在前期研究的基础上探讨中药山茱萸环烯醚萜苷类成分莫诺苷对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖抑制的影响及其抗肿瘤的机制,为寻找和开发抗黑素瘤的有效药物提供理论依据。目的:研究中药山茱萸环烯醚萜苷类成分莫诺苷诱导人恶性黑色素瘤A375细胞凋亡的作用和机制。方法:1.取对数生长期的A375细胞进行药物干预,分为空白对照组(不进行干预),阳性对照组(顺铂进行干预),给药组(不同浓度的莫诺苷进行干预)。2.倒置显微镜观察不同浓度的莫诺苷作用A375细胞24 h后,细胞的形态变化。3.利用细胞增殖抑制试验MTT法检测不同浓度的莫诺苷作用A375细胞24 h后,细胞增殖的影响。4.采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染检测不同浓度的莫诺苷作用A375细胞24 h后,细胞凋亡率的变化。5.Western Blot检测不同浓度的莫诺苷作用A375细胞24 h后,MAPK信号通路相关蛋白的表达。6.Western Blot检测不同浓度的莫诺苷作用A375细胞24 h后,细胞周期蛋白CyclinD1和P21、Bcl-2家族蛋白Bax和Bcl-2表达的影响,并用抑制剂阻断MAPK信号通路后对上述蛋白的影响。7.应用RT-qPCR检测不同浓度的莫诺苷作用A375细胞24 h后,细胞凋亡基因Bax和Bcl-2 mRNA表达的影响。结果:1.莫诺苷对A375细胞形态的影响倒置显微镜观察经莫诺苷作用A375细胞24 h后,脱壁漂浮增多,细胞皱缩,间隙变大,密度降低,贴壁变少,随着剂量的增加更加明显。2.莫诺苷对A375细胞增殖的影响莫诺苷抑制A375细胞的增殖作用明显,随着浓度增加增殖能力下降,呈剂量依赖性关系。3.莫诺苷对A375细胞凋亡率的影响不同浓度的莫诺苷作用A375细胞24h后,细胞凋亡率随着浓度加大而升高,凋亡作用明显,呈剂量依赖性关系。4.莫诺苷对MAPK信号通路的影响不同浓度的莫诺苷作用A375细胞24h后,经Western Blot检测结果显示,ERK1/2、JNK和p-JNK、p38MAPK、p-p38MAPK、蛋白表达均无明显影响,但p-ERK1/2蛋白表达明显上升,差异有统计学意义(P<0.01)。5.莫诺苷对周期蛋白的影响不同浓度的莫诺苷作用A375细胞24h后,经Western Blot检测结果显示,莫诺苷下调细胞周期素CyclinD1,并可上调P21蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.01)。预先加入MAPK抑制剂,结果显示加入ERK1/2特异性抑制剂U0126后细胞周期素CyclinD1蛋白的表达水平明显上升,P21蛋白的表达水平则明显下降,差异有统计学意义(P<0.01),而加入p38 MAPK抑制剂SB203580后CyclinD1和P21蛋白的表达并无明显影响。6.莫诺苷对Bcl-2家族的影响经Western Blot检测和RT-qPCR检测,不同浓度的莫诺苷作用A375细胞24h后,结果显示随着剂量的增加,Bcl-2蛋白的表达水平逐渐降低,Bax蛋白的表达逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.01),Bcl-2的mRNA表达水平逐渐下调,Bax的mRNA表达逐渐上调,表明莫诺苷可以在蛋白和基因水平影响Bcl-2和Bax的表达。预先加入MAPK抑制剂,结果显示加入ERK1/2特异性抑制剂U0126后Bcl-2蛋白的表达水平明显上升,Bax蛋白的表达水平则明显下降,而加入p38 MAPK抑制剂SB203580后Bax和Bcl-2蛋白的表达均无明显影响。结论:1.莫诺苷对A375细胞增殖有显著的抑制作用,呈剂量依赖性关系。2.莫诺苷明显促进A375细胞凋亡,呈剂量依赖性关系。3.莫诺苷能阻滞细胞周期,促进凋亡基因的表达发挥抗肿瘤的作用,其机制可能与激活ERK/MAPK信号通路有关。