基质硬度对施耐德膜源干细胞形态及生物学行为的影响

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目的:上颌窦底提升术常用于解决种植手术中上颌后部缺牙区骨量不足的问题。手术过程简要概括为将上颌窦粘膜抬高,并根据需要在粘膜与窦底的骨壁之间植入生物材料。然而,这项技术的原理仍存在争议。目前,一部分学者提出,上颌窦粘膜中存在干细胞,具有诱导成骨分化的潜能,因而上颌窦底提升中的新生骨可能是施耐德膜源干细胞(maxillary Schneiderian sinus membrane-derived stem cells,MSSM-derived stem cells)产生的。其中,MSSM来源的干细胞如何响应环境的生物力学特性值得深入探索。在众多生物物理信号中,基质硬度已被证实能通过机械相互作用影响多种细胞的生物学行为和功能,且对不同细胞影响具有差别。目前,仍然缺乏硬度对MSSM来源的干细胞影响的相关研究,本实验拟分离培养鉴定MSSM来源的干细胞,并进一步探索硬度对其形态,粘附,增殖和成骨分化的影响。研究MSSM来源的干细胞的生物学行为以及探寻如何提升该细胞的成骨能力,能对上颌窦底提升的临床操作及生物材料的选择提供一定理论基础。方法:1.MSSM来源的干细胞分离培养与鉴定从日本白兔体内提取上颌窦粘膜后,酶消化法将组织分散为单个细胞,行原代细胞培养。细胞培养至2-4代后,以细胞成球实验检测其自我更新能力;流式细胞术鉴定表面标志物;三向诱导分化后,分别用茜素红,油红和阿利新蓝染色鉴定其成骨,成脂和成软骨分化能力。2.硬度对MSSM来源的干细胞的形态,粘附和增殖行为的影响将细胞培养在不同基质硬度表面后,使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)和异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)标记的鬼笔环肽荧光染色后观察其形态;黏着斑蛋白荧光染色后观察其粘附行为;采用CCK-8评估基质上培养不同时间后的细胞增殖情况。3.硬度对MSSM来源的干细胞的体外成骨能力的影响将细胞培养在不同基质硬度表面并进行成骨诱导后,使用实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,q RTPCR)和免疫荧光检测不同时间点,细胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),骨桥蛋白(osteopontin,OPN),成骨特异性转录因子-2(runt-related transcription factor-2,RUNX-2),骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)和I型胶原α1(collagen,type I,alpha 1,COL1A1)的m RNA表达情况和OPN蛋白的表达。结果:1.成功分离并培养MSSM来源的细胞,其具有自我更新能力及成骨,成脂和成软骨多向分化潜能;细胞表面间充质相关抗原CD29,CD90和CD44为阳性,造血相关标记CD34和CD45为阴性。2.将细胞培养在三种硬度的基质上,分别为13-16,48-53和62-68 k Pa。硬度越高越利于细胞的伸展且黏着斑蛋白荧光表达越强,并更利于细胞增殖。3.将细胞培养在三种硬度的基质上并行成骨诱导分化后,硬度越高,细胞内ALP,OPN,RUNX-2,BMP-2和COL1A1的m RNA表达量增加,OPN蛋白表达也增加。结论:本实验提取的MSSM来源的细胞为干细胞。在13-68 k Pa的硬度范围内,硬度越高,越利于细胞的伸展,粘附和增殖。另外,高硬度还能促进MSSM来源干细胞的成骨分化能力。
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