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岩藻糖化糖胺聚糖(Fucosylated glycosaminoglycan,FG)是棘皮动物来源的含岩藻糖基侧链的糖胺聚糖衍生物。FG具有特殊的化学结构(含岩藻糖基侧链的GAG衍生物)和药理活性(强效抗凝和抑制Xase)。已有研究显示,天然FG不仅强效抑制Xase活性,也具有AT和/或HCⅡ依赖的Ⅱa和Ⅹa抑制活性。本课题组前期已相对系统地研究了Xase抑制活性及AT依赖的Ⅱa和Ⅹa抑制活性的构效关系,对HCⅡ依赖的Ⅱa抑制活性的构效关系研究则尚待深入。 目的:系统考察FG分子量(Mw)、侧链岩藻糖化程度(DF)、硫酸酯基取代类型对其HCⅡ依赖的抗Ⅱa活性及其抗凝活性的影响。 方法: (1)H2O2解聚法制备分子量(Mw)不同的系列FG结构修饰样品; (2)温和酸水解法制备岩藻糖化程度(DF)不同的FG系列样品; (3)以不同物种来源的FG制备硫酸化类型不同的FG系列样品; (4)凝血时间检测法分析不同系列的FG样品的抗凝活性; (5)生色底物法检测不同系列的FG样品的HCⅡ依赖的抗Ⅱa活性及其对其它凝血因子活性的影响; (6)生物膜层干涉技术(BLI)研究受试样品与HCⅡ的相互作用。 结果: (1)所得不同Mw、不同DF值以及不同硫酸化类型的FG系列样品的化学结构经NMR谱图解析证实,Mw经HPGPC法检测确认。 (2) APTT及酶学实验结果显示: 对于Mw不同的FG系列样品,当Mw不低于约5.2 kDa时,其APTT延长活性和Xase抑制活性均随Mw降低而减弱;而其HCⅡ依赖的抗Ⅱa活性基本保持稳定,表明Mw对所述样品的HCⅡ依赖的抗Ⅱa活性影响较小; 对于DF值不同的FG系列样品,其APTT延长活性和Xase抑制活性均随岩藻糖化程度的降低而减弱甚至消失;当DF值不低于约16%时,HCⅡ依赖的抗Ⅱa活性随DF降低而略有增强,当DF值降低至约2%时,其活性明显减弱至消失,表明侧链岩藻糖化是FG发挥HCⅡ依赖的抗Ⅱa活性所必需的,而较低DF值(如约16%)的化合物可具有更高的选择性激活HCⅡ的活性。 硫酸化类型不同的FG系列样品的比较研究显示,硫酸酯基取代类型可影响化合物的APTT延长活性、Xase抑制活性及HCⅡ依赖的抗Ⅱa活性,但其清晰的构效关系有待于进一步的实验探讨。 (3)BLI检测结果显示: 天然FG以单相结合模型高亲和力结合HCⅡ。 不同Mw样品比较研究显示,其竞争性结合HCⅡ的能力随Mw降低而减弱。由于这些化合物具有近似的HCⅡ依赖的抗Ⅱa活性,表明较短链长的FG片段即可亲和性结合HCⅡ并使之变构激活,进一步增加化合物链长,虽然可以增强结合HCⅡ的亲和力,但并不能进一步增强HCⅡ的活性。 不同DF值样品比较研究显示,其竞争性结合HCⅡ的能力随DF值降低而减弱。类似地,由于DF值降低时这些化合物HCⅡ依赖的抗Ⅱa活性先略有增强后急剧减弱,表明较低DF值(约16%)时,FG样品即可亲和性结合HCⅡ并使之变构激活,更低的DF值可使其结合HCⅡ的亲和力及变构活性降低,而更高的DF虽能增加其结合HCⅡ的亲和力,但不能提高其HCⅡ的激活活性。 硫酸化类型不同的样品结合HCⅡ的亲和力存在差异。由于不能排除分子量因素的影响,因此硫酸化类型的影响尚待进一步澄清。 结论: (1)FG的化学结构修饰产物可支持其构效关系研究; (2)较短链长(Mw~5.2 kDa)与较低岩藻糖化程度(DF~16%)的FG样品即可产生较强的HCⅡ激活活性,提示HCⅡ的激活效应仅需要较小的特异性结构片段,而硫酸酯基取代类型的影响尚需进一步阐明。 (3)较短的链长与较低DF值的FG样品具有较强的HCⅡ依赖的Ⅱa抑制活性,而其Xase抑制活性及内源性凝血抑制活性较低;较高Mw和较高DF值样品的Xase抑制活性及内源性凝血抑制活性均进一步增加,表明短链长和低DF值的FG样品可选择性激活HCⅡ。