SUMO蛋白酶（Ulp1）是工业和科学研究上常使用的一种高特异性、高活性半胱氨酸蛋白酶,常被用作在蛋白纯化过程中移除目的蛋白N端的SUMO蛋白（Smt3）融合标签。Ulp1通过特异性识别Smt3蛋白结构,切割Smt3蛋白标签并形成具有天然N端的目的蛋白。Ulp1的一个很有趣的生化特性是其可以在底物P1’位点有效识别除Proline以外的其他19种氨基酸。然而,我们对这一生化特性的分子机制了解甚少;并且,其无法对Proline进行识别切割也限制了Smt3及Ulp1在蛋白融合表达、纯化中的应用。本课题针对Ulp1进行了两方面研究:1)依据Ulp1-Smt3互作结构,深入解析Ulp1的底物特异性;2)根据Ulp1蛋白酶底物特异性对Ulp1进行分子改造,使其能够切割P1’位点为Proline的Smt3蛋白标签,从而扩展其在科研、工业以及医学上的应用。首先,我们利用一种基于酿酒酵母内质网滞留筛选系统（YESS）的新策略对Ulp1针对Smt3的特异性在Ulp1-Smt3的互作界面、Smt3的C末端尾部序列和Smt3的P1-P2位点这3个区域进行了研究。我们发现Ulp1-Smt3互作界面上的相互作用位点是功能互补的,单独一个区域的氨基酸突变并不会造成Ulp1对Smt3识别切割能力的丧失。而我们针对Smt3 C末端尾部序列的研究证明Smt3五个氨基酸组成的末端在Ulp1对Smt3的识别中有着重要作用,缺失C末端的E-Q-I氨基酸会造成Ulp1针对Smt3切割能力的明显下降。同时,我们发现Ulp1针对Smt3的切割位点并不是绝对的,可能会根据氨基酸序列偏好性进行切割位点的位移。我们针对P1-P2位点点突变分析表明Ulp1可在P1位点识别Ala/Gly,在P2位点识别Ala/Gly/Ser/Cys,并且对P1位点特异性明显高于P2位点。结合Ulp1针对Smt3的特异性与蛋白结构模拟分析,我们认为Trp448、Ser513、His514、Trp515与Cys580在Ulp1中共同组成了特殊并且狭窄的底物口袋,限制了Smt3P1-P2位点的氨基酸大小,其中包括Trp448侧链的芳香环与P1-P2位点Gly-Gly肽键环形成的π-π叠加力来固定P1-P2-P1’位点氨基酸的朝向。在SUMO蛋白酶分子改造中,我们通过结构分析发现Ulp1 S1’底物口袋的特殊结构导致了P1’位点Proline的闭合侧链对Cys580催化氨基酸的激活以及对底物肽键的接触有阻遏作用。因此,我们选取了S1’底物口袋中Ser513、Leu533、Asn576、Gly577、Tyr578这5个氨基酸来构建突变体库,希望获得可针对P1’位点为Proline进行切割的Ulp1突变体。利用YESS对突变体库经过多轮流式细胞仪分选,我们获得一系列突变体。对这些突变体序列分析表明:1)Y578G的突变对Ulp1 S1’底物口袋的结构改变至关重要,2)533、576、577位点产生了芳香族氨基酸偏好,3)在Ser513位点出现了缺失突变。随后,我们着重分析了ZHR2-1和ZHR3-10优势突变体,其对于底物Smt3Gly Gly↓Pro序列切割效率分别达到50%和90%。以ZHR2-1为例,对ZHR2-1-Smt3结构模拟解析中发现Ulp1涉及P1-P2结合的狭窄底物口袋的改变对于Ulp1针对的P1’位点Proline的切割至关重要。在ZHR2-1突变体中,Asn576、Gly577、Tyr578位点的突变造成了底物口袋的开放,使P1’位点Proline的侧链基团朝向产生变化,从而使Ulp1催化氨基酸Cys580能够接触并切割P1-P1’之间的肽键。其中Y578G突变尤为重要,能够扩大S1’底物口袋空间并且解除对Arg446的空间阻遏使其能够在与Ser577形成的氢键相互作用中被拉近Ser577。Arg446空间结构的变动使Trp448位点产生位移,破坏了Trp448侧链的芳香环与P1-P2位点Gly-Gly肽键环形成的π-π叠加力,从而解除对Smt3Gly Gly Pro序列朝向的固定。值得注意的是,这一空间结构变化被G576Y突变进一步稳定。终上所述,我们解析了Ulp1对Smt3的特异性识别与切割,并通过结构模拟与高通量筛选手段结合,通过分子改造初步解决了Ulp1对Smt3 Gly Gly↓Pro序列的不切割难题,扩大了Ulp1的应用领域。这些结果促进了我们对Ulp1的理解,拓宽了其应用范围。并且,这也是第一次对底物是蛋白而不是短肽的蛋白酶定向进化研究中的一次成功尝试。