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紫花苜蓿(Medicago sativa subsp.sativa L.)是一种广泛种植的豆科牧草,因其较高的营养价值被誉为“牧草之王”。然而,非生物逆境严重阻碍着紫花苜蓿的生长和生产。由于基因组信息的不完整以及表达谱数据的匮乏,与传统作物相比,关于紫花苜蓿抗逆基因的挖掘刚刚起步。为了全面的揭示紫花苜蓿在响应冷胁迫过程中基因表达的变化,本研究利用高通量测序BGISEQ-500技术并结合全长转录组数据,比较了 4℃冷胁迫条件下紫花苜蓿的转录组动态特征。MYB基因家族在植物响应非生物逆境中扮演着重要作用,但是在紫花苜蓿中尚未进行系统研究。在前期转录组实验的基础上,本研究对紫花苜蓿MYB基因家族进行了识别与鉴定,分析了不同成员在冷等非生物胁迫条件下的表达模式,并通过遗传转化在拟南芥和紫花苜蓿中鉴定了MsMYB144的基因功能。主要研究结果如下:1、分析了冷胁迫条件下紫花苜蓿8个生理指标的变化特征。结果表明,与对照相比,冷胁迫条件下紫花苜蓿中的离子泄漏水平、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)含量、过氧化氢(H202)含量、丙二醛(MDA)含量以及脯氨酸(PRO)含量都表现出不同程度的上升趋势。然而,3个冷处理时间点下(C2、C3和C4)的紫花苜蓿叶绿素含量显著的低于正常温度条件下的叶绿素含量(P<0.05)。2、在全长转录组水平分析了紫花苜蓿对冷胁迫的响应。(1)利用高通量测序平台PacBio全长转录组和BGISEQ-500平台对4℃冷胁迫条件下(2 h、6 h、24 h和48 h,每个时间点3个生物学重复)的紫花苜蓿进行转录变化的分析,共识别出50,809个已注释的unigenes和5,283个差异表达基因;(2)代谢通路富集分析表明,这些差异表达基因主要参与碳水化合物的代谢、光合作用、植物激素信号转导以及氨基酸的合成等生物过程;(3)在紫花苜蓿响应冷胁迫的过程中,GSH、PRO、CAT和POD等相关基因的表达模式与其对应的生理变化趋势相一致;(4)48 h冷处理过程中一些相关基因的表达模式表明,有些转录因子在紫花苜蓿响应冷胁迫的过程中具有重要的作用,例如MYB、AP2、NAC和WRKY等转录因子。3、在全基因组水平研究了紫花苜蓿MYB基因家族对冷等非生物胁迫的响应,并对其预测的互作基因进行酵母双杂交验证。(1)本研究共获得了 265个紫花苜蓿MYB蛋白,包括50个R1-MYB蛋白、186个R2R3-MYB蛋白、26个R1R2R3-MYB蛋白和3个atypical-MYB蛋白。通过进化分析,这些预测的MsMYB蛋白被分为12个亚组;(2)表达模式和qRT-PCR分析结果显示,部分MsMYB基因可能在紫花苜蓿响应非生物胁迫过程中具有重要作用;(3)本研究共预测出170对蛋白-蛋白互作和914对蛋白-DNA互作基因。酵母双杂交系统验证结果表明,MsMYB043 和 MSAD320162、MsMYB253 和 MSAD320162 以及MsMYB253和MSAD308489之间存在明显的互作关系。4、鉴定了紫花苜蓿MsMYB144的基因功能。(1)是一种R2R3-MYB转录因子,它含有3个外显子和2个内含子。pLexA-MsMYB144酵母细胞可在SD/-U-H+X-gal诱导型培养基上变为蓝色,这表明MsMYB144蛋白在酵母中具有转录激活的功能,证明它是一个转录因子。在ABA、冷、干旱和盐处理条件下,MsMYB144的表达可被显著诱导;(2)在4℃冷胁迫条件下,过表达MsMYB144拟南芥幼苗和野生型之间无明显差异。但在响应盐胁迫的过程中,转基因株系的侧根数量和存活率都显著的高于野生型(P<0.05);同时,过表达MsMYB144拟南芥幼苗也能降低对ABA的敏感性;(3)通过遗传转化的方法,共获得54个过表达MsMYB144紫花苜蓿阳性苗,阳性率为56%。与对照相比,过表达MsMYB144紫花苜蓿幼苗也能增强其耐盐能力;(4)在盐胁迫过程中,过表达MsMYB144紫花苜蓿和拟南芥幼苗中类黄酮的含量都显著积累(P<0.05);(5)获得了 14个MsMYB144 RNAi转基因紫花苜蓿株系,其MsMYB144基因的表达水平均低于野生型。这些结果表明,MsMYB144基因能够提高紫花苜蓿和拟南芥的耐盐能力,但其潜在的作用机理仍需进一步研究。