肝纤维化(hepatic fibrosis)是多种病因所致的慢性肝损伤的修复反应,是慢性肝病转化为肝硬化和肝功能衰竭的必经阶段和共同病理基础,因此,预防、治疗甚至逆转肝纤维化是阻断肝硬化的关键环节。研究证实肝纤维化是由于胶原合成、沉积与降解和吸收的动态平衡被破坏,使胶原的合成与沉积大于降解和吸收,致使细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)过度沉积为典型特征,在这一过程中炎症反应、氧化应激、免疫反应和细胞凋亡等病理生理过程发挥了重要的作用。我国是肝病高发国家,目前尚无有效的抗肝病药物,如何阻止或逆转ECM过度沉积成为治疗慢性肝病的关键,也是国内外学者的研究重点。Rho蛋白作为小分子的鸟苷酸结合蛋白,属于Ras超家族成员,被称为“分子开关”。ROCK是Rho A下游最主要的效应分子,是丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶家族成员。近年来研究发现,激活的Rho A/ROCK信号转导通路能够介导细胞粘附与迁移、肌动蛋白骨架形成及细胞增殖和凋亡等多种生物学功能,这些效应在多种器官组织慢性炎症纤维化中发挥了重大作用。有研究表明,选择性阻断该信号通路可以改善纤维化器官的进展和预后。法舒地尔作为唯一一种被应用于临床的Rho激酶选择性抑制剂,主要用于预防蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛,改善由此引起的脑缺血症状,应用后药物迅速向肝、肾、脾和肠等组织中转移,在上述组织中含量较高。我们以往的研究发现法舒地尔可以抑制脂质过氧化反应,提高机体抗氧化能力,发挥对心肌的保护作用,但其在肝纤维化进程中的作用机制目前尚不清楚。本研究拟采用代谢性疾病、化学因素及免疫性损伤三种不同因素所致的大鼠肝纤维化模型,应用药理学、形态学、分子生物学等多种实验方法来探讨Rho A/ROCK信号转导通路在肝纤维化中的作用,及法舒地尔对肝纤维化进展的影响及其可能的作用机制。第一部分Rho A/ROCK信号转导通路对糖尿病大鼠肝纤维化模型炎症反应的影响及其机制研究目的:采用链脲佐菌素诱导的1型糖尿病大鼠为模型,探讨Rho A/ROCK信号转导通路对肝纤维化的作用并观察法舒地尔的抗炎抗纤维化效应及其机制。方法:健康成年雄性SD大鼠(5~6周)共50只,随机分为空白对照组和模型组。模型组一次性腹腔注射1%的STZ 60 mg/kg,5日后断尾取血,血糖≥15 mmol/L入组,表示造模成功。其中模型组分为:单纯糖尿病组、Fas低剂量组、Fas高剂量组和卡托普利组,每组10只。分别给予等容积柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、Fas 2 mg/kg/d、10 mg/kg/d,腹腔注射,卡托普利30 mg/kg/d灌胃。各组大鼠普通喂养8周后处死。测量体重、肝重,计算肝脏重量指数;常规检测血清中AST、ALT和Hb A1C;采用石蜡切片通过苏木精伊红染色法(H&E)和马松三色法观察肝脏的形态学变化;ELISA方法检测肝脏组织炎症指标TNF-α、IL-6变化;Western blot方法检测肝脏组织中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、NF-κBp65和IκBα表达;RT-PCR方法测定肝脏组织Collα1 mRNA,Rho A mRNA及Rock-1mRNA含量。结果:1正常对照组大鼠一般状况好,而模型组大鼠出现典型的糖尿病“三多一少”表现。DM组大鼠的平均体重明显低于NC组,下降了27.14%(P<0.05),而LW和LWI显著增加(P<0.01)。高剂量法舒地尔(H-Fas)明显减轻了大鼠体重的下降的趋势,肝重增加的趋势也明显减轻(P<0.01)。2模型组大鼠的ALT、AST、TNF-α、IL-6及糖化血红蛋白含量明显高于对照组(P<0.01),表明高血糖引起的一系列炎症反应,引起大鼠肝功能异常。法舒地尔治疗后ALT、AST水平与模型组相比显著降低,血清中TNF-α和IL-6也有明显降低(P<0.01),且高剂量组比低剂量组更有效。卡托普利治疗组中上述指标较DM组也有明显降低,但各治疗组中Hb A1C并无统计学区别。3 H&E切片染色结果显示模型组大鼠肝小叶结构被破坏,肝细胞结构紊乱,炎细胞浸润明显,纤维组织增生,包绕汇管区。给予法舒地尔治疗后,可见组织学变化明显减轻,细胞排列趋于规则,炎细胞减少,纤维组织减少。马松三色染色结果可见模型组胶原纤维大量增生,给予治疗后,细胞外基质大量减少,胶原纤维形成减少(P<0.05),且与给药剂量呈依赖关系,高剂量Fas组效果更明显(P<0.01)。4模型组大鼠的TGF-β1、TIMP-1表达水平显著提高,MMP-9的表达明显减少(P<0.01)。应用法舒地尔治疗后,肝脏TGF-β1、TIMP-1表达水平显著降低,MMP-9表达相应的增强。法舒地尔高剂量组的影响大于低剂量组(P<0.01)。研究发现模型组大鼠肝脏中NF-κBp65表达较正常对照组显著增加,应用法舒地尔治疗后这种增加的趋势明显变缓。而IκB的表达则呈现出相反的趋势。5与正常对照大鼠相比,糖尿病大鼠肝脏组织中Collα1 mRNA表达显著的增加,表明在糖尿病大鼠中肝脏纤维化已经形成(P<0.01)。应用法舒地尔治疗组的糖尿病大鼠肝脏中Collα1 mRNA较明显减少,表明抗肝纤维化的代偿机制被启动。L-Fas组和H-Fas组中Rho A mRNA、ROCK-1 mRNA的表达均有不同程度的减少,表明Rho A/ROCK通路确实参与了糖尿病肝纤维化的过程,而这一抗纤维化作用与胶原的形成是紧密相联的(P<0.01)。第二部分Rho A/ROCK信号转导通路对四氯化碳所致大鼠肝纤维化模型凋亡的影响及其机制研究目的:采用四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化的模型,探讨Rho A/ROCK信号转导通路对肝纤维化的影响及法舒地尔的抗凋亡效应及其作用机制。方法:健康成年雄性SD大鼠(5~6周),随机分为空白对照组和模型组。模型组给予50%CCl4植物油混合液1 ml/kg腹腔注射,每周2次,给药8周。其中模型组分为:单纯CCl4组、Fas低剂量组、Fas高剂量组和卡托普利组,每组10只。分别给予等容积缓冲液、Fas 2 mg/kg/d、10mg/kg/d,腹腔注射,卡托普利30 mg/kg/d灌胃。各组大鼠普通喂养8周后处死。测量体重、肝重,计算肝脏重量指数;常规检测血清中AST及ALT;采用石蜡切片通过苏木精伊红染色法(H&E)和马松三色法观察肝脏的形态学变化;Western blot方法检测Bcl-2和Bax表达;RT-PCR方法检测肝脏组织caspase-3 mRNA,Rho A mRNA及ROCK-1 mRNA含量。结果:1模型组动物与正常组大鼠相比出现明显精神萎靡,反应变慢,体毛干枯,体重下降。大鼠的平均体重明显低于NC组,下降了29.34%(P<0.05),而LW和LWI显著增加(P<0.01)。2模型组大鼠血清ALT、AST较对照组明显升高(P<0.01),表明大鼠肝功能受损严重。法舒地尔治疗后大鼠血清ALT、AST明显下降,其中低剂量组ALT、AST分别下降了25.47%和9.87%,高剂量组ALT、AST分别下降了45.34%和21.84%(P<0.01),高剂量组下降趋势明显优于低剂量组。卡托普利治疗组大鼠血清ALT、AST较模型组有明显降低(P<0.01)。3正常对照组可见肝小叶结构完整,肝细胞无脂肪变及炎细胞浸润,无坏死和纤维组织增生。模型组肝小叶结构破坏,肝细胞排列紊乱,明显肿胀、变性。可见大小不等的脂肪空泡形成,部分呈现气球样变,可见凋亡小体形成。汇管区大量淋巴细胞浸润,中央静脉偏位或缺如。肝小叶周围明显坏死,胶原增生显著,并向肝小叶内部延伸,部分粗大纤维隔包绕肝细胞,假小叶形成。治疗组未见假小叶形成,有纤维增生,且仅仅局限在汇管区,以肝细胞脂肪变性坏死为主。4 Bcl-2/Bax的比率决定了细胞的生存或凋亡。模型组大鼠肝脏中,Bcl-2表达显著降低下降而Bax表达显著升高,Bcl-2/Bax比例降低,说明肝细胞凋亡增多(P<0.01);而经法舒地尔和卡托普利干预后,Bcl-2表达显著升高,而Bax表达显著降低,Bcl-2/Bax比值升高,表明上述药物有效抑制凋亡。5模型组大鼠肝脏中caspase-3 mRNA的表达较对照组显著升高(P<0.01),Rho A mRNA和ROCK-1 mRNA表达均增加;法舒地尔干预组大鼠肝脏组织中caspase-3 mRNA的表达较单纯模型组大鼠显著降低(P<0.05),Rho A mRNA和ROCK-1 mRNA表达均受到抑制,且高剂量组比低剂量组降低的更显著,表明肝细胞的凋亡受到了抑制。卡托普利组也有类似的降低表现。第三部分Rho A/ROCK信号转导通路对猪血清所致大鼠肝纤维化模型氧化应激反应的影响及其机制研究目的:采用猪血清诱导的免疫性大鼠肝纤维化的模型,探讨Rho A/ROCK信号转导通路对肝纤维化的作用及法舒地尔的抗氧化作用。方法:健康成年雄性SD大鼠(5~6周),随机分为空白对照组和模型组。模型组给予猪血清0.5 ml/只腹腔注射,每周2次,给药8周。其中模型组分为:单纯猪血清组、Fas低剂量组、Fas高剂量组和卡托普利组,每组10只。分别给予等容积缓冲液、Fas 2 mg/kg/d、10 mg/kg/d,腹腔注射,卡托普利30 mg/kg/d灌胃。各组大鼠普通喂养8周后处死。测量体重、肝重,计算肝脏重量指数;常规检测血清中AST及ALT;比色法测量肝脏组织匀浆中SOD活性和MDA含量;肝脏的形态学变化和纤维化程度采用石蜡切片通过苏木精伊红染色法(H&E)及马松三色法进行观察;采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定肝脏组织TGF-β1 mRNA、Rho A mRNA及ROCK-1 mRNA含量。结果:1模型组大鼠与正常组大鼠相比一般状况相似,个别毛色较正常组略发黄,体重变化无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠体重及肝脏重量变化不明显,肉眼下肝脏与正常组大鼠肝脏类似(P>0.05)。2模型组大鼠血清ALT、AST较对照组明显升高,分别增加了222.85%和273.34%(P<0.01),表明大鼠肝功能受损严重。法舒地尔治疗后大鼠血清ALT、AST明显下降(P<0.01),且高剂量组下降趋势明显优于低剂量组(高剂量组的ALT下降了52.93%,AST降低53.54%)。卡托普利治疗组大鼠血清ALT、AST较模型组也有明显降低(P<0.05)法舒地尔治疗后大鼠肝功能明显好转(P<0.05),且呈剂量依赖性。卡托普利治疗组大鼠血清ALT、AST较模型组有明显降低(P<0.05)。3 H&E染色观察显示,给与低剂量或高剂量法舒地尔治疗后,组织学改变显著减轻,表现为肝细胞排列规则,成纤维细胞和脂肪空泡减少。马松染色结果显示肝脏组织纤维化面积与法舒地尔给药呈剂量依赖性,随着给药剂量的增加而缩小(P<0.05)。4模型组与正常对照组比较肝脏组织内MDA含量明显升高,增加了77.78%,SOD活性明显降低(50.01%)(P<0.01)。与模型组比较,法舒地尔低、高剂量组肝脏组织MDA含量降低,SOD活性明显升高。高剂量组改变更明显,MDA含量降低了19.98%(P<0.05),SOD活性增加54.55%(P<0.01);卡托普利治疗组肝脏组织内MDA含量降低(P<0.05),SOD活性明显升高(P<0.01)。(见Table 3、Fig.3、Fig.4)表明法舒地尔和卡托普利都发挥了抗氧化作用。5与正常对照组相比,模型组大鼠肝脏组织中TGF-β1 mRNA表达显著的增加(P<0.01)。应用法舒地尔治疗组的大鼠肝脏中TGF-β1 mRNA较明显减少,表明抗氧化应激的代偿机制被启动。法舒地尔组中Rho A mRNA、ROCK-1 mRNA具有不同程度的表达减少,表明Rho A/ROCK通路确实参与了肝纤维化的过程。结论:1高糖可以激活Rho A/ROCK通路,ROCK抑制剂法舒地尔可阻断糖尿病肝纤维化大鼠Rho激酶信号通路,减少炎症因子的产生,继而影响NF-κB的激活和转位发挥抗炎作用,从而减轻炎症反应,延缓肝纤维化的进展。2法舒地尔通过抑制四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型中Rho A/ROCK通路的激活,调控Bcl-2/Bax比例,下调caspase-3的表达,从而抑制细胞凋亡,延缓肝纤维化的发展。3 Rho A/ROCK通路被抑制能够减轻猪血清诱导的免疫性肝损伤大鼠模型的氧化应激水平,改善肝脏受损状态,延缓肝纤维化发生。综上所述,在肝纤维化的发展过程中,Rho A/ROCK通路被激活。ROCK抑制剂法舒地尔可以通过降低炎症反应、减少细胞凋亡、抑制氧化应激等多种途径减轻肝脏损伤,减少胶原表达,延缓肝纤维的进展,因此有可能是防治肝纤维化的治疗新途径。