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藻蓝蛋白是蓝藻的一种胞内蛋白,具有良好的抗氧化性、抗炎性、抗癌性和荧光性,在食品、化妆品和医药行业具有良好的应用价值。藻蓝蛋白按照纯度不同可分为食品级、医药级和试剂级,纯度越高,价值越大。目前,以巢湖蓝藻为处理对象提取纯化试剂级藻蓝蛋白的研究很少,还基本停留在实验室研究过程中,试剂级藻蓝蛋白的提取纯化工艺技术组合方式的研究也不够系统化。因此,本文的基本思路是,以巢湖水华新鲜蓝藻为处理对象,实验探索巢湖水华新鲜蓝藻中藻蓝蛋白的提取纯化的工艺技术,建立试剂级藻蓝蛋白提取纯化的组合工艺技术方案,建立一定规模的中试生产线,掌握扩大规模生产的基本运行参数,并运用紫外-可见吸收光谱法,分析试剂级藻蓝蛋白提取纯化工艺组合的纯化机理,为巢湖水华蓝藻高附加值资源化的研究提供支撑。具体研究内容与结果有:(1)通过对巢湖水华蓝藻资源化的调查,综合分析比较了蓝藻资源化的几个方向,将蓝藻资源化划分为一般附加值、较高附加值和高附加值三个方向,综合比较得出藻蓝蛋白的提取纯化是蓝藻高附加值资源化研究的一个重要方面。另外,系统性比较了藻蓝蛋白提取技术和纯化技术,并结合理论分析和实际情况,预先选择了藻蓝蛋白提取纯化基本技术路线,为实验研究的开展提供了先期指导。(2)冻融法破壁提取获得藻蓝蛋白粗提液的实验室研究结果表明,蓝藻含水率为96.5%,冷冻温度为-20℃,0.75%(W/V)的磷酸盐缓冲液作为冻融介质,开展冻融实验2次,破壁获得的藻蓝蛋白粗提液纯度和得率达到最大值,分别为0.451和3.73%。考虑中试放大的实际情况,直接选择打捞的含水率约96%的水华新鲜蓝藻为处理对象,选择冻融温度在-15℃以下,冻融次数为1次,直接选取冻融介质为去离子水的条件进行中试实验,减少操作步骤,简化操作方式,获得的蓝藻破壁粗提液中藻蓝蛋白得率>3%,纯度>0.35,说明了中试实验中采用冻融法破壁具有良好效果。(3)六步分段盐析法纯化藻蓝蛋白的实验结果表明,奇数次盐析(NH4)2SO4的摩尔浓度可选择1.0 mol/L,偶数次盐析(NH4)2SO4摩尔浓度可选择1.8mol/L。另外,经二步盐析获得的藻蓝蛋白纯度上升为2.26,回收率为77.38%。经四步盐析获得的藻蓝蛋白纯度上升为3.48,回收率为54.92%。经六步盐析获得的藻蓝蛋白纯度上升为3.71,回收率为45.98%。借助于紫外-可见吸收光谱法分析发现,一步盐析的主要作用在于去除了杂蛋白、少量未完全去除的细胞壁残渣、少量的核酸类物质和维生素类等浅黄色物质,二步盐析能大量去除大量核酸类和维生素类物质,三步盐析能继续去除少量核酸类和部分其他蛋白质,四步盐析主要是进一步去除其他蛋白对藻蓝蛋白的影响,五步和六步盐析导致了同时损失了部分藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白,但不能将这两种性质相近的蛋白质分离开。(4)两步分段盐析联合柱层析法精致纯化藻蓝蛋白的实验结果表明,两步分段盐析后,先接纤维素(Cellufine A-500),再接羟基磷灰石(HA)柱层析能获得纯度大于4.0以上的藻蓝蛋白。将两步盐析后获得的藻蓝蛋白溶液先过Cellufine A-500层析柱,上样体积占柱床体积的2/3,以20mmol/L、pH=6.5的磷酸盐缓冲液进行无梯度洗脱,再采用20mmol/L、pH=6.5的磷酸盐缓冲液溶液分别加入0.1、0.3、1.5mol/L NaCl进行分级梯度洗脱,洗脱流速为6ml/min,藻红蛋白先洗脱出来。将后洗脱组分再过HA层析柱,使1/3-2/3柱床着色,先以10mmol/L、pH=7.0的磷酸盐缓冲液进行无梯度洗脱,再采用20、50、100mmol/L、pH=7.0的磷酸盐缓冲液溶液并加入0.1mol/L NaCl进行分级梯度洗脱,洗脱流速为4ml/min,藻蓝蛋白先洗脱出来,后洗脱出的组分主要成分为别藻蓝蛋白,获得的两种蛋白质的纯度均大于4.0。(5)利用紫外-可见吸收光谱法扫描两步盐析联合两步柱层析各阶段的藻蓝蛋白溶液和去除或分离的杂质液,可以明显发现,一步Cellufine A-500柱层析主要作用在于先将藻红蛋白分离出来。第二步HA柱层析的主要作用在于将藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白分离开,先出组分为藻蓝蛋白,后出组分为别藻蓝蛋白。经四步纯化组合工艺后,藻蓝蛋白溶液在紫外区的吸收谱带中,最大吸收峰逐步从260nm、269nm、277nm红移至280nm。在可见光区的吸收谱带中,最大吸收峰逐步从617nm、618nm红移至620nm,藻蓝蛋白溶液纯度逐步上升。(6)藻蓝蛋白中试提取纯化工艺组合方式选定为一步冻融法破壁获得藻蓝蛋白粗提液-一步二级膜去渣浓缩获得食品级藻蓝蛋白溶液-两步分段盐析一般纯化获得药品级藻蓝蛋白溶液-两步柱层析精致纯化获得试剂级藻蓝蛋白溶液,该单元式组合提取纯化工艺具有良好的效果,同时获得了纯度大于4.0以上的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。将藻蓝蛋白溶液进行了紫外-可见光谱扫描、电泳鉴定和荧光分析,结果表明,纯度大于4.0以上的试剂级藻蓝蛋白具有良好的光谱吸收特性和荧光性。