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乳腺癌是严重危害妇女健康的重大疾病，近年其发病率呈逐年上升趋势，尽管手术、放化疗等综合治疗已在临床上广泛应用，但其远期生存率并未得到明显改善，每年仍有约50万人死于乳腺癌，其主要死因源于乳腺癌转移，已成为乳腺癌防治中的一大难题。细胞自噬属于Ⅱ型程序性细胞死亡，是指隔离膜包裹细胞质和/或细胞器形成自噬体，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体并在其中发生降解的过程。最近的研究发现，细胞自噬在乳腺癌细胞的增殖转移中发挥重要作用，阐明其机制对于提高乳腺癌的诊治水平具有重要意义。干扰素调节因子4-结合蛋白(Interferon regulatory factor4-binding protein, IBP)是在人免疫系统中大量表达并具有参与免疫突触形成和维持免疫内环境稳定等重要功能的蛋白质。本实验室前期首次发现IBP异常高表达于乳腺癌组织中，且其表达与乳腺癌增殖转移密切相关，提示IBP有望成为乳腺癌诊断和防治的新靶点。然而，目前关于IBP调节乳腺癌增殖转移的机制尚不清楚。鉴于自噬在乳腺癌细胞的增殖转移中发挥重要作用，而PI3K/Akt/mTOR信号通路是抑制细胞自噬的关键信号通路，结合IBP可激活PI3K的文献报道，我们推测IBP可能通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，调节乳腺癌细胞自噬而影响其增殖转移。本课题组合应用激光共聚焦、透射电镜、Western Blot、免疫荧光等多种技术，以IBP表达不同的乳腺癌细胞株为对象，通过体内、外增殖和转移模型，在研究IBP调节自噬与乳腺癌增殖转移关系的基础上，探讨了IBP调节自噬对乳腺癌增殖转移的作用及其主要分子机制。主要研究内容和结果：一、IBP抑制乳腺癌细胞自噬1.应用稳定的两对IBP高低表达不同的乳腺癌细胞株(MDA-MB-231/IBP RNAi及MDA-MB-231/control siRNA、MDA-MB-468-EGFP-IBP及MDA-MB-468-control vector)为研究对象，经HBSS饥饿刺激后，Western Blot结果显示，IBP抑制乳腺癌自噬标志物LC3Ⅱ的表达，并抑制LC3Ⅱ的底物P62的降解。2.上述两对细胞经HBSS刺激后，激光共聚焦结果显示，IBP抑制乳腺癌细胞中自噬标志物RFP-LCⅡ的形成。3.上述两对细胞经HBSS刺激后，透射电镜结果显示，IBP抑制乳腺癌细胞中自噬泡的形成。二、IBP通过激活mTORC2信号通路抑制乳腺癌细胞自噬1.将MDA-MB-231/IBP RNAi及MDA-MB-231/control siRNA乳腺癌细胞株，经过qRT-PCR分析，结果显示IBP上调乳腺癌细胞株中PI3K/Akt/mTOR信号通路中关键分子PI3K、Akt、mTOR、Rictor的基因表达水平。2.前述两对IBP高/低表达不同的乳腺癌细胞株，经HBSS刺激不同时间后， WesternBlot结果显示， IBP不仅激活乳腺癌细胞株mTORC2信号通路中关键分子(p-mTORSer2481、p-Akt Ser473、p-FOXO3a Thr32)的表达，同时还激活mTORC1信号通路中关键分子(p-mTORSer2448、p-P70S6K T389、p-4E-BP1Thr37/46)的表达。3.应用PI3K抑制剂LY294002、mTORC1抑制剂Rapamycin以及mTORC2抑制剂OSI-027作用于上述两对IBP高/低表达不同的乳腺癌细胞株， Western Blot检测结果显示，IBP主要是通过激活mTORC2信号通路抑制自噬的。4.进一步应用mTORC1抑制剂Rapamycin或mTORC2抑制剂OSI-027或两者同时刺激上述两对IBP高/低表达不同的乳腺癌细胞株后， Western Blot结果证明IBP是通过激活mTORC2信号通路中关键分子：p-mTOR Ser2481、p-Akt Ser473、p-FOXO3a Thr32的表达而抑制乳腺癌细胞自噬的。三、细胞模型证实IBP抑制自噬促进乳腺癌细胞增殖转移与其激活mTORC2信号通路有关1.应用mTORC1抑制剂Rapamycin或者mTORC2抑制剂OSI-027或两者同时刺激上述两对IBP高/低表达不同的乳腺癌细胞株48h后， MTT检测结果证明IBP抑制自噬促进乳腺癌细胞增殖转移与其激活mTORC2信号通路有关。2.上述细胞经同样处理后，克隆形成实验结果显示， IBP抑制自噬促进乳腺癌细胞克隆形成与其激活mTORC2信号通路有关。3.上述细胞经同样处理后，伤痕愈合实验结果显示，IBP抑制自噬促进乳腺癌细胞迁徙与其激活mTORC2信号通路有关。4.上述细胞经同样处理后，小室侵袭实验结果显示，IBP抑制自噬促进乳腺癌细胞侵袭与其激活mTORC2信号通路有关。四、动物模型证实IBP抑制自噬促进乳腺癌细胞增殖转移与其激活mTORC2信号通路有关1.裸鼠皮下接种MDA-MB-231/IBP RNAi及MDA-MB-231/control siRNA乳腺癌细胞株，2周后取其接种瘤，透射电镜观察到MDA-MB-231/IBP RNAi接种瘤中的自噬泡多于对照组，Western Blot技术证明在接种瘤组织中IBP通过激活mTORC2信号通路抑制乳腺癌自噬。2.上述接种瘤模型待瘤体长出后，尾静脉注射mTORC1抑制剂Rapamycin或者mTORC2抑制剂OSI-027或两者同时给药，接种瘤生长曲线结果表明，IBP抑制自噬促进乳腺癌生长与其激活mTORC2信号通路有关；HE染色结果显示，IBP抑制自噬促进乳腺癌肝转移和肺转移与其激活mTORC2信号通路有关。五、乳腺癌临床标本证实IBP抑制自噬与其激活mTORC2信号通路有关1.采用乳腺癌组织芯片(包括100例乳腺癌组织及10例正常的癌旁组织)，免疫组化结果显示，IBP与LC3Ⅱ负相关(P<0.001)，IBP与p-mTOR Ser2481正相关(P<0.001)。2.通过免疫组化技术检测临床7例乳腺癌切除术病人的癌组织和其癌旁组织中的IBP、LC3Ⅱ、mTORC2信号通路关键分子(p-mTOR S2481, p-Akt S473, p-FOXO3a T32)的表达情况，结果发现，IBP在乳腺癌组织中的表达明显高于同一病人的癌旁组织，而LC3Ⅱ在乳腺癌组织中的表达明显弱于癌旁组织中的表达。在乳腺癌组织中的p-mTOR S2481, p-Akt S473,p-FOXO3a T32的表达明显强于癌旁组织中的表达，表明乳腺癌组织中mTORC2信号通路呈激活状态。3.另取乳腺癌切除术病人的癌组织和其癌旁组织固定后，透射电镜结果发现，癌旁组织中的自噬泡数量显著多于乳腺癌组织中的自噬泡。六、激活自噬抑制乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药性MTT检测证实自噬激动剂Rapamycin可降低乳腺癌细胞对紫杉醇耐药性，增强紫杉醇对乳腺癌细胞的抑制作用，而自噬抑制剂3-MA在一定程度上增强乳腺癌细胞紫杉醇耐药性，拮抗紫杉醇对乳腺癌细胞的抑制作用。本文结论：IBP具有抑制乳腺癌细胞自噬的作用，IBP抑制自噬与其促进乳腺癌增殖转移有密切关系，IBP激活mTORC2信号通路是其重要机制。本研究结果有助于完善对乳腺癌自噬与增殖转移机制的认识，为临床乳腺癌的诊治提供新的思路及靶点。