论文部分内容阅读
第一部分F2对AngII诱导的心肌细胞肥大的抑制作用 目的： 探讨碘化 N-正丁基氟哌啶醇（N n-butyl haloperidol iodide，F2）对血管紧张素 II（Angiotensin II，AngII）诱导的H9C2细胞肥大的抑制作用。 方法： 1. AngII诱导H9C2细胞肥大模型的建立 用含10％FBS的高糖DMEM培养基培养H9C2细胞48 h，换含有1%FBS的DMEM培养液同步化24 h后，分别加入不同药物孵育48 h。实验分组：①正常对照组（Control）：1% FBS的DMEM培养液；②模型组（AngII）：AngII10-7mol/L。采用Image Pro Plus6.1软件测量细胞表面积大小；BCA法测定细胞总蛋白含量。 2. F2对AngII诱导H9C2细胞肥大的影响 用含10%FBS的高糖DMEM培养基培养H9C2细胞48 h，换1%FBS的DMEM培养液同步化24 h后，分别加入不同药物孵育48 h。实验分组：①正常对照组（Control）：1%FBS的DMEM培养液（下同）；②模型组（AngII）：AngII10-7mol/L；③DMSO+AngII组：DMSO10-5mol/L+AngII10-7mol/L；④ F210-8mol/L+AngII组：同时加入 F210-8mol/L和AngII10-7mol/L；⑤F210-7mol/L+AngII组：同时加入 F210-7mol/L和AngII10-7mol/L；⑥F210-6mol/L+AngII组：同时加入F210-6mol/L和AngII10-7mol/L；④、⑤、⑥组F2各浓度均预先孵育细胞30 min。检测各组H9C2细胞的表面积和蛋白含量的改变（方法同上）。 结果： 1．AngII诱导 H9C2细胞肥大模型的建立：与Control组相比，AngII（10-7mol/L）孵育48 h后，细胞表面积增加了1.75倍（p<0.01），细胞蛋白含量增加了46%（p<0.01）。模型建立成功，重复性好。 2．F2对 AngII诱导 H9C2细胞肥大表面积的影响：与Control组比较，AngII组和DMSO+AngII组细胞表面积显著性增大（P<0.01），而两组之间差异无统计学意义（P>0.05）；F210-8mol/L+AngII组心肌细胞表面积增加至2.29倍，F210-7mol/L+AngII组心肌细胞的表面积增加至1.99倍；与AngII组相比，F210-8mol/L+AngII组心肌细胞表面积减少了17%（P<0.01），F210-7mol/L+AngII心肌细胞的表面积减少28%（P<0.01）。 3．F2对AngII诱导 H9C2细胞肥大蛋白含量的影响：与Control组比较，AngII组和DMSO+AngII组细胞总蛋白含量显著升高（P<0.01），前两组之间差异无统计学意义（P>0.05）；F210-8mol/L+AngII组心肌细胞蛋白含量增加至1.3倍，F210-7mol/L+AngII组心肌细胞蛋白含量增加至1.23倍；与AngII组相比，F210-8mol/L+AngII组心肌细胞蛋白含量减少了10.6%（P<0.01），F210-7mol/L+AngII组心肌细胞的蛋白含量减少了16%。 小结： 1．AngII能诱导 H9C2细胞肥大，表现在细胞表面积增大和蛋白含量增加。 2．F2可以减少AngII引起的H9C2细胞表面积增大和蛋白含量增加。 第二部分 F2抑制AngII诱导的心肌细胞肥大的机制研究 目的： 在培养的H9C2细胞上，探讨F2抑制AngII诱导的H9C2细胞肥大的机制。 方法： 1．AngII对ERK1/2、p-ERK1/2、CREB和p-CREB蛋白表达的影响：（1）细胞随机分为7组，正常对照组加1%FBS的DMEM培养液，其余各组用终浓度为10-7mol/L的AngII处理，置于5%CO2、37℃恒温培养箱中孵育1 min、3 min、5 min、10 min、30 min、60 min。（2）细胞随机分为5组，正常对照组加DMEM培养液，其余各组用终浓度为10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L的AngII处理，置于5% CO2、37℃恒温培养箱中孵育。采用Western-blot方法检测各组ERK1/2、p-ERK1/2、CREB和p-CREB蛋白含量。 2．F2对 AngII激活的ERK-CREB通路的影响：细胞随机分为6组：①正常对照组（Control）：1% FBS的DMEM培养液（下同）；②模型组（AngII）：AngII10-7mol/L；③DMSO+AngII组：DMSO10-4mol/L+AngII10-7mol/L；④F210-8mol/L+AngII组：同时加入F210-8mol/L和AngII10-7mol/L；⑤F210-7mol/L+AngII组：同时加入 F210-7mol/L和AngII10-7mol/L；⑥F210-6mol/L+AngII组：同时加入 F210-6mol/L和AngII10-7mol/L；④、⑤、⑥组F2各浓度均预先孵育细胞30 min。AngII浓度和作用时间选用最佳作用浓度和时间。采用Western-blot方法检测各组ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB蛋白含量。 结果： 1．AngII的时效变化和量效变化：AngII作用5 min时，p-ERK1/2和p-CREB蛋白表达达到高峰；AngII浓度为10-7mol/L时，p-ERK1/2和p-CREB蛋白表达最高。因此，以AngII10-7mol/L作用5 min为实验条件。 2．F2对 AngII激活的ERK-CREB通路的影响：与Control组相比，AngII组和DMSO+AngII组p-ERK1/2、p-CREB蛋白表达均有增加（P<0.01），AngII组和DMSO+AngII组之间无显著性差异（P>0.05）；与AngII组相比，F2（10-6、10-7、10-8mol/L）+AngII各组p-ERK1/2、p-CREB蛋白的表达被明显抑制（P<0.01）。各组间ERK1/2、CREB蛋白表达没有统计学差异（P>0.05）。 小结： 1．在培养的H9C2细胞上，AngII能时效和量效依赖的激活ERK-CREB通路。 2．F2能剂量依赖的抑制AngII激活的ERK-CREB通路蛋白表达水平的上调,可能参与心肌肥大的过程。 第三部分 F2对AngII激活的VSMCs中ERK-CREB通路的影响 目的： 在培养的VSMCs上，探讨F2对AngII激活的ERK-CREB通路的影响。方法： 1．AngII对ERK1/2、p-ERK1/2、CREB和p-CREB蛋白表达的影响：（1）细胞随机分为7组，正常对照组加1%FBS的DMEM培养液（下同），其余各组用终浓度为10-7mol/L的AngII处理，置于5%CO2、37℃恒温培养箱中孵育1 min、5 min、10 min、20 min、30 min、60 min。（2）细胞随机分为5组，正常对照组加 DMEM培养液，其余各组用终浓度为10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L的AngII处理，置于5% CO2、37℃恒温培养箱中孵育。采用Western-blot方法检测各组ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB蛋白含量。 2．F2对 AngII激活的ERK-CREB通路的影响：细胞随机分为6组：①正常对照组（Control）：1% FBS的DMEM培养液（下同）；②模型组（AngII）：AngII10-7mol/L；③DMSO+ AngII组：DMSO10-4mol/L+AngII10-7mol/L；④F210-8mol/L+AngII组：同时加入F210-8mol/L和AngII10-7mol/L；⑤F210-7mol/L+AngII组：同时加入 F210-7mol/L和AngII10-7mol/L；⑥F210-6mol/L+AngII组：同时加入F210-6mol/L和AngII10-7mol/L；④、⑤、⑥组F2各浓度均预先孵育细胞30 min。AngII作用浓度和时间选用最佳作用浓度和时间。采用Western-blot方法检测各组ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、p-CREB蛋白含量。 结果： 1． AngII的时效变化和量效变化：AngII作用5 min时，p-ERK1/2和p-CREB蛋白表达达到高峰；AngII浓度为10-7mol/L时，p-ERK1/2和p-CREB蛋白表达最高。因此，以AngII10-7mol/L作用5 min为实验条件。 2． F2对 AngII激活的ERK-CREB通路的影响：与Control组相比，AngII组和DMSO+AngII组p-ERK1/2和p-CREB蛋白表达均有增加（P<0.01），AngII组和DMSO+AngII组之间无显著性差异（P>0.05）；与AngII组相比，F2（10-6、10-7、10-8mol/L）+AngII各组p-ERK1/2蛋白的表达被明显抑制（P<0.05）, F210-8mol/L+AngII组p-CREB蛋白表达没有统计学差异（P>0.05），F2（10-6、10-7mol/L）+AngII各组p-CREB蛋白的表达被明显抑制（P<0.05）各组间ERK1/2和CREB蛋白表达没有统计学差异（P>0.05）。 小结： 1．在培养的血管平滑肌细胞上，AngII能时间和剂量依赖的激活ERK-CREB通路。 2．F2能剂量依赖的抑制AngII激活的ERK-CREB蛋白表达水平的上调。 结论： 1．F2能抑制AngII诱导的心肌细胞肥大，其机制可能是通过抑制ERK-CREB通路来实现的。 2．F2能抑制AngII诱导VSMCs中ERK1/2、CREB的活化。血管紧张素II