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第一部分重组慢病毒介导的MCM7基因沉默对白血病K562细胞生物学效应的影响及其机制的研究目的:鉴于特异性抑制MCM7基因表达能够抑制白血病的发生发展,研究抑制微小染色体维持蛋白7 (minichromosome maintenance protein, MCM7)后相关基因表达的变化,为进一步了解白血病的发生机制和将MCM7引入白血病的基因靶向治疗提供实验理论依据。方法:1、Easy-siRNA设计:通过Genebank找到MCM7mRNA序列,设计3条针对MCM7编码区的siRNA靶序列,并经Blast确定序列特异性,在序列两端加相应的限制性内切酶切位点。2、目的慢病毒载体的构建:3种带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)筛选标记的MCM7基因沉默重组慢病毒颗粒LV-MCM7-RNAi(23977-1),LV-MCM7-RNAi(23978-1),LV-MCM7-RNAi(23979-1)及阴性对照重组病毒 LV-NC-RNAi,构建 MCM7 特异性shRNA重组病毒。3、3种MCM7特异性shRNA重组病毒分别转染K562细胞株,荧光显微镜下观察转染效率。Real-time PCR分别检测MCM7转录水平,筛选出靶点敲减效率最高的一种重组慢病毒颗粒。4、通过Real-time PCR及Western blot检测转染前后对MCM7转录及蛋白的表达的抑制情况。5、按照重组病毒干预与否,分为LV-MCM7-RNAi组、LV-NC-RNAi对照组和空白对照组。体外通过应用FCM检测K562细胞周期及凋亡情况。体外探讨特异性抑制MCM7的表达对K562细胞的生物学特性的影响。6、采用Real-time PCR及Western blot法进行验证,找寻起关键作用的信号途径,初步阐明MCM7在白血病的作用和分子机制。7、建立白血病移植瘤的动物模型:BALB/C裸鼠随机分为3组,建立局部移植瘤模型。每天观察裸鼠背部移植瘤的成瘤和生长情况,绘肿瘤生长曲线,每4天记录一次。8、肿瘤病理组织学检查:取各组裸鼠的肿瘤组织Real-time PCR和Western blot检测肿瘤标本内MCM7基因转录及蛋白的表达。同时制作病理切片进行免疫组化染色。结果:荧光显微镜显示重组病毒对目的细胞的感染效率>90%, Real-time PCR及Western blot显示LV-MCM7-RNAi组与LV-NC-RNAi组和空白对照组相比,MCM7基因转录和蛋白的表达均显著下调,靶点敲减效率分别达(92.3±1.88) %和(91.18±0.93) %。CCK8结果显示:自第24h起,稳转株细胞的增殖与两组对照细胞相比明显受抑制。FCM结果显示LV-MCM7-RNAi组较LV-NC-RNAi组和空白对照组G0/G1期细胞比例明显增加,而S期显著减少,M期也有小幅度减少,细胞周期被阻滞在G1期。FCM凋亡检测LV-MCM7-RNAi组细胞凋亡率为(45.12±1.68)%,明显高于 LV-MCM7-RNAi 组(7.96士0.85)%和空白对照组(8.37±1.02)%。Western blot 显示 LV-MCM7-RNAi 组的 Polo-Like 激酶 1 ( PLK1)及磷酸化的PLK1(p-PLK1)均较LV-NC-RNAi组和空白对照组表达明显下调,而P73、bax基因表达上调。实验动物模型生长曲线表明LV-shRNA-MCM7重组病毒组裸鼠的肿瘤生长明显慢于LV-shRNA-negative对照组和空白对照组。结论:MCM7基因沉默使肿瘤细胞被阻滞在G1期,DNA无法复制,增殖受抑制。因周期阻滞作用,PLK1基因无法激活,PLK1及pPLK1蛋白表达下调,从而使其对抑癌基因p73基因转活性的抑制作用降低,p73基因及其下游基因bax表达上调,导致肿瘤细胞凋亡增加。第二部分重组慢病毒介导的MCM7基因沉默对肝癌MHCC-97H细胞生物学效应的影响目的:本研究探讨应用慢病毒介导的RNAi技术特异性沉默MCM7基因对肝癌细胞MHCC-97H生物学效应的影响。方法:以人MCM7编码序列作为干扰靶点,构建靶向MCM7的shRNA慢病毒载体,转染肝癌细胞MHCC-97H,建立稳定转染细胞株。按照重组病毒干预与否,分为LV-MCM7-RNAi组、LV-NC-RNAi对照组和空白对照组。应用实时定量PCR及Western blot检测各组肝癌细胞MCM7表达的变化。MTT检测细胞增殖情况,流式细胞技术检测细胞周期及细胞凋亡,划痕法检测迁移能力改变,Transwell侵袭小室实验以穿膜细胞的数量评估各组肝癌细胞的侵袭能力。结果:荧光显微镜显示重组病毒对目的细胞的感染效率>90%, Real-time PCR及Western blot结果显示LV-MCM7-RNAi组MCM7 mRNA及蛋白的表达水平较阴性对照组(LV-NC-RNAi)及空白对照组显著降低(P<0.05)。MTT结果显示LV-MCM7-RNAi组细胞增殖速度显著抑制(P<0.01)。流式细胞仪检测细胞周期显示LV-MCM7-RNAi组较LV-NC-RNAi组和空白对照组G0/G1期细胞比例明显增加,而S期显著减少,细胞周期被阻滞在G1期。同时LV-MCM7-RNAi组的细胞凋亡率显著增加。在MCM7基因有效沉默后,肝癌细胞MHCC-97H的侵袭及迁移能力显著下降(P<0.05)。结论:慢病毒介导的shRNA能有效沉默肝癌MHCC-97H细胞MCM7基因的表达,肿瘤细胞的细胞周期被阻滞于GO/G1期,并能诱导肿瘤细胞凋亡。同时,MCM7基因沉默可抑制肝癌MHCC-97H细胞的体外增殖、侵袭等生物学效应。