药物引起的肝损伤（Drug induced Liver Injury, DILI）是导致人体肝脏疾病的重要病因，也是大多数药物被迫撤市或者受黑框警告的主要原因之一，不仅给病患带来巨大痛苦，同时也给医药公司、社会带来重大的经济损失。研究发现线粒体毒性是这些药物引起肝脏毒性的重要机制之一，然而目前在药物临床前安全性评价中，还没有可用的、有效的检测药物的肝脏线粒体的毒性的评价方法。对乙酰氨基酚（Aceta minop he n, APAP）是临床上使用极为广泛的解热镇痛药物之一，在治疗剂量下使用是安全的，一旦过量服用，可引起严重的肝损伤，甚至导致死亡。APAP是肝脏线粒体毒性的典型代表药物，其主要毒性机制是引起线粒体功能障碍，目前的多数研究主要关注的是APAP对线粒体功能的影响，几乎未提及 APAP对线粒体数量和线粒体新生的影响。PGC-1α是调控线粒体新生的关键调节因子，可与下游的NRF-1/2、TFAM分子作用，介导线粒体的生物合成，形成新的线粒体。同时，PGC-1α可调控多种线粒体抗氧化蛋白以防御氧化应激。另外， APAP作为肝脏线粒体毒性的典型代表药物，其毒性机制研究相对较为清楚，实验相关的研究数据较为充足，为 APAP引起肝脏损伤的AO P（Adverse Outcome Pathway, AOP）框架的构建奠定了机制基础，提供了大量的素材。因此，本研究依据美国国家研究咨询委员会（National Research Council, NRC）2007年提出的21世纪毒性测试策略，即基于毒性通路测试的理念，通过体外研究探讨APAP引起肝脏线粒体毒性的相关机制和毒性通路，重点关注介导线粒体新生和抗氧化反应的PGC-1α信号通路是否是 APAP引起肝脏线粒体毒性的相关毒性通路，同时基于本研究获取的相关指标时效和量效反应关系，以期为具有肝脏线粒体毒性的化合物/药物的风险评估提供数据支持和可用的体外测试方法。　　本研究利用人肝癌细胞系HepG2细胞为细胞模型，检测不同浓度APAP引起的细胞毒性、线粒体内RO S水平、线粒体膜电位和ATP水平以观察APAP对线粒体功能的影响；检测mt DN A的拷贝数、线粒体组成蛋白N D1和V DAC的蛋白表达水平、线粒体数量以观察APAP对线粒体新生的影响；检测PGC-1α信号通路的mRN A水平和蛋白水平以分析APAP对该通路的影响；检测PGC-1α的磷酸化水平和SIRT1的蛋白水平，以观察 PGC-1α的蛋白活性；检测抗氧化分子/抗氧化酶 Nrf2、HO-1、NQO-1、MnSOD蛋白表达和GSH的含量，以分析PGC-1α与抗氧化状态的关系。　　同时，检测了与凋亡相关的调控分子Caspase3、Cytc、Bax和信号通路分子JNK、p-JNK的表达，以确定APAP引起HepG2细胞死亡的方式和机制。　　另外，通过多种数据库进行 APAP的研究文献检索和专家咨询，并对所得资料进行梳理、分析，寻找AOP框架中的分子起始事件（molecular initiating event, MIE）、其下游的关键事件（key events, KEs）和有害结局（adverse outcome, AO），进而构建APAP引起肝损伤的AOP框架，并采用 Bradford Hill准则对其进行证据权重的评估，回答OECD提出的AOP可信性评价的关键问题对其可信度进行评价。　　研究结果显示无细胞毒性浓度的APAP对线粒体膜电位、PGC-1α/N RF-1/TFAM的mRN A和蛋白表达水平、mt DN A拷贝数、线粒体数量、N D1和VD AC的蛋白表达水平、SIRT1蛋白表达水平、抗氧化蛋白/酶Nrf2、HO-1、NQO-1、MnSOD等蛋白表达水平和GSH含量均有显著的促表达或者提高的作用，而有细胞毒性浓度的APAP对以上指标都产生了剂量依赖性的抑制作用，对细胞生存率、mt DN A拷贝数、线粒体膜电位、PGC-1α/NRF-1/TFAM蛋白表达水平引起了显著的下降，对抗氧化蛋白有抑制作用但是不显著。APAP对线粒体ROS的水平、LDH的漏出、PCC-1a的磷酸化水平呈浓度依赖性增加，从2 mM开始出现显著变化。APAP能降低ATP水平但是不显著。　　在细胞死亡机制研究中，APAP引起细胞出现浓度依赖性的凋亡和核DNA断裂，而无坏死。p-JNK/JNK，线粒体中的Bax，细胞质中的Cyt c等蛋白的蛋白水平呈浓度依赖性的升高，p-JNK从0.5 mM开始显著升高，Bax和Cyt c从2 mM开始显著升高，而Caspase3的蛋白表达呈浓度依赖性降低，但是未见其活性剪切片段。　　结合体外的实验数据，并通过文献梳理分析确定了APAP引起肝脏损伤的MI E为APAP代谢产为NAPQI与细胞内蛋白分子的结合，KEs包括氧化应激、MPT的发生、Cyt c的漏出和Endo G的转位、肝细胞的坏死/凋亡，AO为肝损伤。　　综上所述，在HepG2细胞上，观察的APAP细胞生存率与临床毒性效应类似，表明该细胞系可以作为APAP毒性研究的体外细胞模型；无细胞毒性的APAP引起了线粒体的新生和抗氧化蛋白表达水平的增加，是细胞的一种适应性反应以防御 APAP诱发的线粒体毒性作用，且这个过程受 PGC-1α分子调控；高浓度的APAP对线粒体新生有显著抑制作用，可能是 APAP引起线粒体毒性的机制之一，而对抗氧化系统虽有抑制但是不显著，表明 PGC-1α调控的线粒体新生对 APAP的线粒体毒性更为敏感，即PGC-1α-TFAM-mtDNA通路比PGC-1α-Nrf2-MnSOD通路更为敏感，在毒性预测中应优先考虑；在PGC-1α浓度-效应反应和时间-效应反应中的“tipp ing po int”浓度低于细胞生存率出现显著下降的浓度，表明基于 PGC-1α分子进行风险评估比常用的细胞生存率更为敏感，且这些数据为后期风险评估中毒性通路数学模型的建立提供了数据支持。另外，通过检测凋亡的相关分子和信号通路，首先，我们确定了在Hep G2细胞中，高浓度APAP引起了细胞死亡的方式是凋亡而非坏死，其次，APAP引起凋亡的机制并不是启动了p-JNK-Bax-Cyt c-Caspase3信号通路，而可能是p-JNK-Bax-Endo G信号通路，为APAP在细胞模型上的毒性通路终点的确定提供了证据。根据O EC D提出的AO P构建指导原则，通过文献查阅、分析、整合，我们成功构建并评价了APAP引起肝脏损伤的AO P框架，为具有潜在线粒体毒性化合物的筛选和药物的线粒体毒性评价提供了新思路和体外测试方法。