【摘 要】
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芽孢杆菌（Bacillus）在木质素生物质降解利用中具有广阔的应用前景,当前对其降解木质素的机理研究还不透彻,有待深入探究。本课题组前期从肉牛粪便中分离到一株可降解木质素的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MN-13,并证实该菌株的漆酶（CotA）和染料脱色过氧化物酶（BaDyP）可降解β-O-4木质素。在此基础上,本文采用非标记的定量蛋白质组学技术研究了 MN
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芽孢杆菌（Bacillus）在木质素生物质降解利用中具有广阔的应用前景,当前对其降解木质素的机理研究还不透彻,有待深入探究。本课题组前期从肉牛粪便中分离到一株可降解木质素的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MN-13,并证实该菌株的漆酶（CotA）和染料脱色过氧化物酶（BaDyP）可降解β-O-4木质素。在此基础上,本文采用非标记的定量蛋白质组学技术研究了 MN-13菌株在以碱木质素和木质素模式化合物为唯一碳源的无机盐培养基中培养48 h后蛋白的表达情况。进而揭示菌株对木质素的代谢过程,并筛选木质素降解关键基因进行异源表达和功能验证。与对照组（无机盐培养基）相比:（一）碱木质素实验组蛋白组学分析结果显示831个蛋白表达量发生显著变化,404个蛋白显著上调,427个蛋白显著下调。在以碱木质素为唯一碳源时,过氧化物酶、双加氧酶、超氧化物歧化酶、氧化还原酶以及参与脂质合成和代谢的酶均差异表达。为深入阐明MN-13菌株对碱木质素的降解过程,对差异表达蛋白进行功能分类、功能富集及聚类分析。结果表明:差异蛋白多参与生物合成和代谢相关过程,富集于生物合成调节和氨基酸代谢通路,以及与木质素降解相关的苯甲酸降解通路和三羧酸循环。综合蛋白组学分析结果发现:MN-13菌株可通过β-酮己二酸途径（β-ketoadipate pathway）、苯甲酸盐降解途径（Benzoate pathway）和 4-羟基苯乙酸途径（4-hydroxyphenylacetic acid pathway）降解碱木质素;降解产物乙酰CoA可进入三羧酸循环和脂质合成过程。（二）木质素模式化合物A（2-苯氧基-1-苯基-丙烷-1,3-二醇）实验组中338个蛋白表达量显著变化,228个蛋白显著上调,110个蛋白显著下调;木质素模式化合物B（1-（3,4-二甲氧基苯基）-2-（2-甲氧基苯基）-丙烷-1,3-二醇）实验组中296个蛋白差异表达,139个蛋白显著上调,157个蛋白显著下调。A组中环裂解双加氧酶、血红素依赖过氧化物酶和超氧化物歧化酶均差异表达;B组细胞色素P450酶、乙酰CoA脱氢酶、转移酶、羧化酶、合成酶和环裂解双加氧酶均差异表达。两组中均存在环裂解双加氧酶的显著上调,表明两者中均存在β-酮己二酸降解途径。因乙酰CoA脱氢酶、转移酶、羧化酶参与脂质的合成,推测MN-13菌株易利用化合物B进行胞内脂质的合成和代谢,这一差异可能是因为化合物A和B取代基的不同,导致参与两者降解的酶存在差异表达。两组中应激蛋白和丙酮酸脱氢酶复合体均显著上调,说明以化合物A或B为碳源时,刺激了 MN-13菌株中应激蛋白的表达,同时促进丙酮酸转化为乙酰CoA进入三羧酸循环产能。通过分析MN-13菌株在不同碳源下蛋白的表达情况,发现细胞色素P450酶参与多个代谢过程,且存在差异表达,环裂解双加氧酶在不同碳源下表达量均显著上调。本文以MN-13菌株基因组为模板,成功克隆出分子量大小为3 186 bp的yetO基因,编码分子量约为120 kDa的细胞色素P450酶（CYP102A2）。通过HPLC-MS分析重组CYP102A2酶对木质素模式化合物的降解作用。并对前期获得的环裂解双加氧酶进行功能验证。结果发现:重组CYP102A2酶可催化异阿魏酸和GGE脱芳-O-甲基;环裂解双加氧酶可催化对苯二酚和多种邻苯二酚类化合物开环,且对邻苯二酚类化合物催化活性高。综上所述,本研究阐明了 B.amyloliquefaciens MN-13的木质素降解机理,为芽孢杆菌在木质素降解方面的应用提供理论支撑。
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