一、背景原发性高血压是常见也血管疾病,发病率高,肾脏为高血压影响的最重要的祀器官。高血压过程中Angll水平升高,刺激血管内皮损伤,使NADPH氧化酶表达增加,ROS生成增多,推动氧化应激,通过多种炎症信号通路产生大量炎症细胞因子,因此氧化应激和炎症共同促进肾脏小动脉血管内皮细胞损伤、重构,肾小球系膜增生、肥厚和细胞外基质沉积形成肾损害,并对血压进一步影响,从而形成恶性循环,这就是我们课题所要研究的高血压肾损害发病机制中的非血流动力学因素,而通过文献研究及前期的预实验我们发现N0X4介导的ROS释放増多,并进一步激活NF-kB信号通路的开放造成炎症因子释放増多从而导致肾脏损害是我们研究内容的主要方面,另一方面TLR相关信号通路是近年来研巧热点,其中TLR2/4研究最广泛与深入,重点表达于肾脏的多个区域,尤其是存在于肾小球系膜细胞,两者在介导肾脏纤维化导致肾损害的过程中意义重大。最新指南推荐RASS阻断剂(ACEI、ARB)为高血压肾损害的治疗药物,两者都有明确的疗效,但是获益人群有限,需要有益的补充,当前对高血压肾损害的治疗不但要强调降压达标带来的肾保护作用,而且要重视药物特有的肾保护作用。潜阳育阴颗粒为江苏省中医院院内制剂,主要用1^^治疗高血压及肾损害之"肝肾阴虚"为主,临床用于治疗高血压肾损害,前期研巧疗效显著,可改善患者症状及肾损害各项指标,可做为重要的补充治疗方案,相关分子机制虽有初步研究,但主要作用祀点不明确,还需要进一步探讨。二、目的本论文首先研究了潜阳育阴颗粒含药血清对肾小球系膜细胞增殖活力的影响,在明确其具有抑制肾小球系膜细胞増殖的基础上,研巧了潜阳育阴颗粒含药血清抑制Angll诱导肾小球系膜细胞增殖相关氧化应激及炎症信号通路的保护机制;然后根据前期的实验选用SH民大鼠做为高血压肾损害模型,研究了药物体内抗氧化应激及炎症反应的作用。两者相互印证阐明潜阳育阴颗粒主要通过重要氧化酶N0X4介导的NF-kB信号通路,部分通过TLR2/4/MyD88信号通路起到防治高血压肾损害的目的。三、方法1.体内实验WKY大鼠为正常组,SHR随机等分为4组,分别为模型组(SHR)、潜阳育阴颗粒组(SHR+Q)、贝那普利组(SHR+B)、潜阳育阴颗粒+贝那普利组(SHR+Q+B)。以上每组大鼠8只,灌胃给药,每日1次,连续8周。末次给药1d后,取大鼠肾脏做以下检测。①前期做过大量的整体动物实验,实验报道中已经检测包括潜阳育阴颗粒对SHR大鼠血压的影响,ELISA法检测用药前后血液及肾脏中AngⅡ、AT1R的表达,全自动生化仪和放免法检测药物对大鼠肾脏损害相关指标如：尿微量白蛋白(尿m-ALB),尿β2-微球蛋白、尿N-乙酰-p-D-葡萄糖苷酶(尿NAG)的改善作用,采用HE, Masson染色检测,光镜下观察大鼠肾脏局部组织形态学用药前后变化,实验均证明潜阳育阴颗粒具有防治高血压。肾损害作用,具体结果可参考前期研究[1-5]；②Western Blot法检测SHR大鼠肾脏局部氧化应激相关指标NOX4；③Western Blot法检测SHR大鼠肾脏局部相关炎症反应的指标包括Myd88、TLR4、TLR2、NF-κB P65、 TNF-α、IL-6蛋白量表达的影响。2.体外实验将Wistar大鼠随机分为正常组、缬沙坦组、潜阳育阴颗粒组,每组10只,灌胃给药,制备含药血清。。肾小球系膜细胞(HMCs)分为5组,除正常组外,其余组均采用10-4mol/L AngⅡ作用于对数生长期的HMCs建立细胞增殖模型。造模后,根据预实验分别给予相应含药血清干预：正常组(5%无药大鼠血清)、模型组(5%无药大鼠血清)、阳性药组(2.5%缬沙坦含药血清+2.5%无药大鼠血清)、潜阳育阴颗粒低剂量组(1.25%潜阳育阴颗粒含药血清+3.75%无药大鼠血清)、潜阳育阴颗粒中剂量组(2.5%潜阳育阴颗粒含药血清+2.5%无药大鼠血清)、潜阳育阴颗粒高剂量组(5%潜阳育阴颗粒含药血清)①MTT法检测潜阳育阴含药血清对HMCs增殖的干预作用②流式细胞仪检测ROS含量；③Western blot、RT-PCR分别检测氧化应激相关指标NOX4, p22phox, GTP-Racl, Racl蛋白及mRNA含量；④Western Blot检测NF-κB P65、IL-6及TNF-α蛋白表达量；⑤Western blot、RT-PCR分别检测TLR2、TLR4及MyD88蛋白及mRNA含量；⑥Western blot、RT-PCR分别检测干扰RNA沉默NOX4后NOX4, p22phox, GTP-Racl,Racl蛋白及mRNA含量,流式细胞仪检测ROS含量；⑦Western blot、 RT-PCR分别检测干扰RNA沉默TLR2后TLR2、TLR4及MyD88的蛋白及mRNA含量。⑧Western blot检测干扰RNA沉默TLR2或NOX4后NF-κB P65、IL-6及TNF-a蛋白表达量。四、结果：1.体内实验①与WKY相比,SHR组TLR2/4、MyD88蛋白表达明显增加(P<0.01)；与SHR相比,SHR+Q组、SHR+B组及SHR+Q+B组对大鼠肾组织TLR2/4、MyD88蛋白表达均明显下降(P<0.01)；而SHR+Q+B组抑制肾组织TLR2/4、MyD88蛋白表达程度极其显著(P<0.01),并优于SHR+Q组与SHR+B组；②与WKY相比,SHR组IF-κB P65蛋白表达明显增加(P<0.01)；与SHR相比,SHR+Q组、SHR+B组及SHR+Q+B组对大鼠肾组织NF-κB P65蛋白表达均明显下降(P<0.01)；而SHR+Q+B组抑制肾组织NF-κB P65蛋白表达程度极其显著(P<0.01),并优于SHR+Q组与SHR+B组；③与WKY相比,SHR组TNF-α、IL-6蛋白表达明显增加(P<0.01)；与SHR相比, SHR+Q组、SHR+B组及SHR+Q+B组对大鼠肾组织TNF-α、IL-6蛋白表达均明显下降(P<0.01)；而SHR+Q+B组抑制肾组织TNF-a、IL-6蛋白表达程度极其显著(P<0.01),并优于SHR+Q组与SHR+B组；④与WKY相比,SHR组NOX4蛋白表达明显增加(P<0.01);与SHR相比,SHR+Q组、SHR+B组及SHR+Q+B组对大鼠肾组织NOX4蛋白表达均明显下降(P<0.01)；而SHR+Q+B组抑制肾组织NOX4蛋白表达程度极其显著(P<0.01),并优于SHR+Q组与SHR+B组。2.体外实验①潜阳育阴颗粒含药血清对细胞作用24h,均出现不同程度抑制AnglI诱导的细胞过度增殖作用,而中高剂量较低剂量更显著的抑制细胞过度增殖作用(P<0.01)；②AngⅡ对HMCs干预24小时后和正常组相比ROS产生明显增多(P<0.01),而潜阳育阴颗粒含药血清干预后ROS表达均明显降低(P<0.01),并有可能有剂量依赖性；③AngⅡ刺激HMCs后能够明显增加p22phox和NOX4蛋白和mRNA表达量,并激活GTP-Racl (P<0.01),潜阳育阴颗粒含药血清对细胞进行干预之后GTP-Rac1、p22phox、 NOX4的蛋白表达量相对于模型组有显著下调且呈剂量依赖性(P<0.01) , mRNA水平与蛋白western结果吻合。在这所有过程中每一组中的Racl蛋白及mI RNA没有显著的改变；④AngⅡ刺激HMCs后NF-κB P65和下游炎症因子蛋白表达量显著增加(P<0.01)。而潜阳育阴颗粒含药血清干预后,各蛋白表达量均减少,低浓度抑制效果较明显,中高浓度效果显著(P<0.01),呈剂量依赖性；⑤AngⅡ刺激HMCs后能够明显增加TLR2、TLR4及MyD88的蛋白和mRNA表达量(P<0.01),特别是TLR2表达量增加异常明显,因此后期我们将对其进行RNA干扰实验,用于求证药物对此靶点作用。在潜阳育阴颗粒含药血清干预之后蛋白表达量相对于AngⅡ模型组有显著下调且呈剂量依赖性(P<0.01),mRNA水平与蛋白western结果吻合；⑥采用RNA干扰技术对NOX4的活性抑制24h后,结果显示NOX4、p22、GTP-Racl的蛋白表达量分别下降72.7%、69.3%、61.8%,同时也抑制ROS生成,和未使用干扰技术对比有显著性差异(P<0.01),造模成功后再次观察潜阳育阴颗粒含药血清对各蛋白的影响,结果示药物仅在高浓度时对p22ph (?)x、GTP-Racl及ROS表达量有轻度的抑制作用且不明显(P<0.05),低中浓度潜阳育阴颗粒含药血清对各蛋白的影响与AngⅡ组相比均没有统计学意义(P>0.05),RT-PCR结果与Western Blot结果一致；⑦采用RNA干扰技术抑制TLR2的活性,检测了含量明显下降(P<0.01),其中TLR2下降79.4%；造模成功后而加入潜阳育阴颗粒含药血清干预后结果亦可再次抑制TLR4、MyD88的表达量(P<0.01),并且抑制程度与阳性药组相当；⑧在抑制NOX4的基础上再次检测了IL-6、TNF-α及NF-κB P65的蛋白表达量,结果发现而潜阳育阴颗粒干预后仅高浓度的潜阳育阴颗粒含药血清对NF-κB P65及IL-6有轻度的抑制作用(P<0.05),其余浓度均对下游炎症因子无明显影响(P>0.05),可能为主要作用机制。而不同的是我们抑制TLR2的基础上同样再次检测了IL-6、TNF-α及 NF-κB P65的蛋白表达量,发现潜阳育阴颗粒含药血清干预也可再次抑制炎症因子IL-6、TNF-α、 NF-κB P65的表达量(P<0.01),说明TLR2不是主要靶点,仅起部分作用。结论：1.潜阳育阴颗粒主要通过干预AngⅡ/NOX4/ROS通路减少NOX4,Racl和p22phox表达,调控NF-κB信号通路,有效抑制下游IL-6及TNF-α等炎症因子上调造成的ECM沉积,从而改善肾损害,起到一种抗氧化或炎症抑制剂的作用；2.潜阳育阴颗粒可能部分通过阻断TLR2/4/MyD88言号通路,有效抑制TLR2、TLR4及MyD88的大量产生和炎症因子的释放,改善肾损害,也可能起到一种炎症抑制剂的作用；3.潜阳育阴颗粒具有多靶点改善高血压形成的肾纤维化及肾损害的作用。4.潜阳育阴颗粒和贝那普利主要作用机制可能不同,联合可从多方面保护肾脏,起到协同作用,有利于指导临床用药。5.潜阳育阴颗粒各剂量组之间呈一定的剂量依耐性,在大剂量时抑制氧化应激及炎症反应的作用更加明显,可作为临床用药剂量调整的基础。