山药(Dioscorea.opposita Thunb.)是中国的传统药材,其基源植物为薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蓣属(Dioscorea Linn.)植物薯蕷(D.opposita Thunb.在《Flora of China》中,已将其正名为D.polystachyaTurcz.),在其所有品种中又以铁棍山药(D.polystachya ’Tiegun’)为最佳,目前公认的道地性产区为河南温县。国内市场上山药的基源植物存在着三个乱象:薯蓣近缘种的冒充造成物种混乱、铁棍山药的冒充造成品种混乱以及非道地产区冒充河南温县铁棍山药所造成的产区混乱。传统的形态学鉴别对于山药药材及其基源植物难以鉴定,显微鉴别需要较高的专业知识及复杂的操作技术,分子标记的指纹图谱等传统分子鉴定方法操作繁琐、花费的成本较大,因此基于基源植物鉴定的山药药材需要一种简单、快速和准确的方法。本研究搜集了山药基源植物薯蓣5个易混近缘种、14个薯蓣主要品种以及8个铁棍山药主产区的实验材料,分别在物种、品种及区域特异性三个层面建立分子鉴别体系。珠芽是薯蓣重要的营养器官和无性繁殖器官,但目前未见对其发生的分子机理的相关研究。本研究通过对产生珠芽的铁棍山药同株着生和不着生珠茅的叶腋、不产生珠芽的花籽山药的叶腋等3个组织,进行转录组測序分析,旨在发掘参与珠芽发生的基因。具体研究的内容及结果如下:(1)通过 SRAP (Sequence-Related Amplified Polymorphism)分子标记对薯蓣及 5 个近缘种的遗传多样性研究发现,物种之间遗传多样性十分丰富:所筛选出的21对能扩增出清晰并呈现多态性条带的引物组合总共扩增产生了 355条重复性好、清晰的谱带,其中338条带为多态性带,占总扩增条带的95.27%;平均每对引物扩增16.90条带谱和16.10条多态性带。对遗传多样性分析发现遗传多样性总位点系数为Na为1.8963,有效位点系数Ne为1.7506。遗传多样性指数H为0.4840,香农指数I为0.6662。6个物种的总的杂合度Ht为0.4541,物种内的平均杂合度Hs为0.1661。物种间的Gst为0.5711,表明所有遗传变异中的57.11%都出现在物种之间。物种之间存在较为丰富的基因交流(Nm=0.3754)的主要原因是野生薯蓣属物种之间存在有性繁殖的方式。对物种之间的遗传结构研究发现,日本薯蓣(D.japonica Thunb.)的Fis值最低,表明其种内分化程度最高,褐苞薯蓣(D.persisimisPrain&Burkill)的种内分化程度最低,山薯(D.fordii Prain&Burkill)与其他5个物种的遗传差异最大(Fst=0.155),薯蓣与其它5个物种之间的遗传差异最小(Fst=0.038)。对遗传关系的研究发现,薯蓣与日本薯蓣之间遗传关系最近。本研究结合SCAR (Sequence Characterized Amplified Region)标记开发的物种特异性鉴定SRAP-SCAR分子标记,能有效的将薯蓣从其近缘种中鉴定出来。(2)利用 ISAP (Intron Sequence Amplified Polymorphism)分子标记对薯蓣14 个品种进行了遗传关系的分析,结果表明:11对ISAP引物共扩增出95条带,其中91条(95.79%)为多态性带。遗传多样性分析结果显示薯蓣品种之间存在着丰富的遗传多样性:总位点系数Na变化范围为1.8999到2.000,平均值为1.9651。有效位点Ne变化范围为1.1529到1.4271,平均值为1.3018。,遗传多样性指数H变化范围为0.1327到0.2673,平均值为0.2002。香农指数I变化范围为0.2011到0.5832,平均值为0.3102。遗传相似系数与遗传距离分析结果表明,与铁棍山药遗传关系由近到远的品种分别为:太谷山药、糙山药、麻山药、安顺山药、无架双胞山药、细长毛山药、米山药、华蓥山药、花籽山药、小白嘴山药、粗牛腿山药、九斤黄及白玉山药。薯蓣品种遗传关系分析表明,薯蓣品种之间可以明显的分成两大支,并且与形态学特征相关。从11对引物中筛选出1对铁棍山药的特异性引物,扩增得到1条大为435bp的特异性片段。对14个品种140个单株植物进行验证的结果显示铁棍山药10个单株全部在435bp处出现SCAR特异带,其他13个品种没有出现此带。因此本研究开发的ISAP-SCAR标记可以作为铁棍山药的特异分子标记,用来鉴别铁棍山药。(3)利用ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)分子标记对铁棍山药8个产区的产品的遗传多样性特征进行分析,结果表明:遗传多样性总位点系数Na变化范围从1.7789到2.0000,有效位点Ne变化范围为1.0417到1.5503,遗传多样性指数H为0.0794到0.3751以及香农指数I变化范围为0.1864到0.5388,表明了区域之间存在较为丰富的遗传多样性水平。对区域之间的遗传关系研究发现,与河南温县产区遗传关系由近到远的地区分别是江苏徐州、山西太原、山东济宁、湖南浏阳、河北沧州、四川南充和广东东莞,产区间遗传关系的远近与引种年限有关。利用SCAR (Sequence Characterized Amplified Region)技术进行铁棍山药的区域特异性相关的分子鉴别研究,通过ISSR扩增,在引物ISSR4 (ACACACACACACACACC)的扩增产物中获得河南温县铁棍山药的特异性谱带,再将这个条带转化为SCAR标记并进行单株检测,结果表明与河南温县铁棍山药的ISSR-SCAR标记在广东东莞、山东济宁、四川南充、湖南浏阳、山西太原产区中未出现,证明与这个标记能准确鉴别引种时间较长的非道地产区的铁棍山药。利用三种分子标记的数据对薯蓣不同区域、不同品种及不同物种进行联合分析发现,薯蓣及其近缘种在系统树上的位置与单独使用SRAP标记的分析结果相似:与薯蓣遗传关系由近到远的物种依次是日本薯蓣、参薯、无翅参薯、褐苞薯蓣和山薯。(4)本研究通过对铁棍山药同株生成珠芽、不生成珠芽及花籽山药不生成珠芽等3个组织进行转录组測序,结果为:共得到Unigene70480个,对转录组的差异基因分析表明,铁棍山药不生成珠芽的组织相对于生成珠芽的组织,共有6263个Unigene表达上调,有8929个Unigene表达下调;铁棍山药生成珠芽的组织相对于花籽山药,共有13026个Unigene表达上调,有11352个Unigene表达下调。铁棍山药生成珠芽的组织同时相对于其不生成珠芽的部分及花籽山药共有2698个Unigene上调,4949个Unigene下调。将差异基因在多个数据库中进行BLAST比对,最终得到这些Unigenes的注释信息。依据已报道的调控龙舌兰(Agave tequilana Linn.)、台闽苣苔(Titanotrichum oldhamii (Hemsley) Solereder)珠芽发生的关键基因,并结合调控植物侧枝形成的关键基因等,最终选择23个可能参与薯蕷珠芽发生的候选基因。此外,本研究基于转录组数据的SSR (simple sequence repeats)位点分布特征开发得到11102对SSR引物,为进一步的薯蓣育种和遗传图谱构建等工作提供更加丰富的标记选择。