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松弛素家族是一类神经肽激素,包括人类松弛素1（H1 relaxin）、人类松弛素2（H2 relaxin）、人类松弛素3（H3 relaxin）、胰岛素样肽3（INSL3）、胰岛素样肽4（INSL4）、胰岛素样肽5（INSL5）和胰岛素样肽6（INSL6）。小鼠的Rln3在脑和精巢中表达,主要参与生殖、应激反应、摄食活动、记忆活动、渗透压调控、焦虑反应等过程。虽然rln3基因在哺乳类和鱼类精巢中有高水平表达,但关于其对雄性精巢发育和精子发生等的影响研究较少,有待深入研究。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是世界性养殖鱼类,雌鱼的产卵周期大致在14天左右,性成熟在一年左右;雄鱼的性成熟在6个月左右,此外本实验室能成功获得单性鱼苗,个体较大,便于显微注射和取材,是研究鱼类精子发生的良好模型。本课题组之前已有的研究表明,在硬骨鱼类尼罗罗非鱼中,松弛素3（rln3）有两个拷贝:rln3a和rln3b,均在精巢的间质细胞和脑中表达,而且rln3a基因在精巢中的表达量明显高于rln3b基因,rln3b基因在脑中的表达量明显高于rln3a基因。本文以尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）为研究对象,在构建rln3a/3b突变系的基础上,通过设计一系列的实验,探究Rln3a/3b调控精子发生、成熟以及育性的分子机制。本研究通过H.E.、免疫组化、精子活力检测等实验,探究rln3a纯合敲除系对精巢发育、精子发生、成熟、育性以及雄激素合成的影响;通过rln3a+/+XY和rln3a-/-XY精巢体外处理,研究Rln3a调控雄激素合成的分子机制。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立rln3b杂合突变系,进而研究Rln3b对尼罗罗非鱼精巢发育和类固醇合成的影响。具体的研究结果如下:1、Rln3a纯合敲除对尼罗罗非鱼精巢发育、精子发生、精子形态、育性及雄激素合成的影响。H.E.、免疫组化以及Real-time PCR实验结果显示,与rln3a+/+XY精巢相比,rln3a-/-XY的GSI显著升高,精液量增多,但成熟精子数量及各类生殖细胞数量显著降低。精子免疫荧光染色和精子活力分析发现rln3a-/-XY的精子畸形,有双尾现象,精子的平均直线运动、精子活力等显著降低,rln3a-/-XY精液与野生型雌鱼的卵子经过人工授精后,在受精后第6天左右全部死亡,rln3a-/-XY后代存活率显著降低。而且,rln3a基因敲除导致雄激素水平显著降低,类固醇激素合成相关基因（St AR1、Cyp17a1、Cyp11b2）的蛋白水平显著降低,这可能是Rln3a影响精子发生、成熟及育性的原因。2、雄激素11-KT成功回救由于尼罗罗非鱼rln3a基因缺失导致的精子活力下降及育性降低的表型。通过投喂饲料的方式,用11-KT（200ug/g（饲料重））从4月龄开始处理rln3a纯合敲除雄鱼2个月。结果表明,与rln3a-/-组相比,rln3a-/-+11-KT组的精子前向运动比例和精子总活率显著升高,而与rln3a+/+组没有显著差异;rln3a-/-+11-KT组的精子非前向运动比例和不活动精子比例相比rln3a-/-组显著降低,与rln3a+/+组相比也没有显著差异。在后代的存活率方面,经11-KT回救后,回救组的育性明显高于rln3a-/-XY组,后代存活率显著升高。3、Rln3a通过c AMP/PKA信号通路影响雄激素合成。Real-time PCR结果显示,rln3a纯合敲除鱼脑和垂体中Gn RH1、kisspeptin2、fshβ和lhβ基因的表达量显著升高;rln3b基因在rln3a纯合敲除鱼脑和精巢中的表达量显著下降,推测Rln3a/3b都有可能参与HPG轴（下丘脑-垂体-性腺轴）的调控,rln3a和rln3b基因之间可能没有补偿关系。通过Western blotting和Real-time PCR检测发现,rln3a-/-XY精巢的c AMP/PKA信号通路上的基因prkaca和prkacb的表达量显著下降,并且CREB和P-CREB的蛋白表达量与对照鱼rln3a+/+XY相比显著降低,根据以上的结果推测Rln3a影响雄激素合成可能是通过c AMP/PKA信号通路实现的。通过对rln3a+/+XY精巢进行体外处理,结果发现,h CG组(rln3a+/+-h CG)使rln3a基因的表达量明显上升,表明Rln3a在精巢的表达受促性腺激素（GTH）的调控。此外,Real-time PCR的结果显示c AMP/PKA信号通路抑制剂H89在对照组(rln3a+/+-vehicle)和h CG处理组(rln3a+/+-h CG)均能抑制雄激素合成通路基因St AR1、cyp17a1、cyp11a1和hsd11b2的表达。进一步Western blotting检测发现,H89处理导致St AR1和Cyp17a1在蛋白水平上的表达显著降低,c AMP/PKA通路的CREB以及磷酸化p-CREB蛋白水平也显著降低。通过对rln3a-/-XY精巢进行体外处理,进一步研究精巢对h CG处理的响应机制,以及Rln3a影响雄激素合成的分子机制。结果显示,与rln3a+/+-vehicle组相比,rln3a-/--vehicle组的St AR1、cyp17a1、cyp11a1、hsd11b2基因的表达量显著降低;而经h CG处理(rln3a-/--h CG)之后,rln3a-/-精巢中St AR1、cyp17a1、hsd11b2基因的表达显著上调,但St AR1、cyp17a1基因的表达量显著低于rln3a+/+-vehicle组和rln3a+/+-h CG组,进一步证明了Rln3a在HPG轴和精巢的雄激素合成过程中扮演着不可替代的角色。此外,通过c AMP/PKA信号通路的激动剂Forskolin体外处理rln3a-/-雄鱼精巢发现,与rln3a-/--vehicle组相比,激动剂Forskolin的处理(rln3a-/--Forskolin)使雄激素合成通路上的基因St AR1、cyp11a1和hsd11b2显著上调,且cyp11a1和hsd11b2基因的表达量与rln3a+/+精巢没有差异。上述实验进一步证明Rln3a通过c AMP/PKA信号通路影响雄激素合成。4、Rln3基因及其受体在尼罗罗非鱼脑中的表达模式。尼罗罗非鱼脑可分为7部分,分别是嗅球、端脑、下丘脑、中脑、间脑、小脑和延脑。Rln3受体基因包括rxfp3、rxfp3.2a、rxfp3.3b、rxfp3.3a3。Real-time PCR结果显示:rln3a/3b基因及其受体在罗非鱼成年鱼脑的7个分区都有表达,rln3a/3b基因在间脑中表达量最高,且rln3a基因在雌鱼嗅球中的表达量显著高于雄鱼,rln3b基因在雌鱼延脑中的表达量显著高于雄鱼。进一步分析rln3a/3b基因两者在脑分区表达量的比较,结果如下:rln3b基因在雄鱼嗅球和端脑的表达量显著高于rln3a基因,在雌鱼中无显著差别;在雌鱼和雄鱼的下丘脑中,rln3b基因的表达量都显著高于rln3a基因,推测Rln3b可能影响尼罗罗非鱼下丘脑-垂体-性腺轴（HPG轴）的调控。Rln3受体基因在脑分区的表达情况如下:rxfp3基因在雄鱼下丘脑中表达量最高,在雌鱼中脑表达最高;rxfp3.2a基因在雄鱼嗅球中表达量最高,在雌鱼端脑中表达最高;rxfp3.3a3基因在雄鱼小脑中表达量最高,在雌鱼嗅球和延脑中表达最高;rxfp3.3b基因在雌鱼和雄鱼的中脑表达最高。rxfp3.2a基因在雄鱼下丘脑和延脑中的表达量都显著高于雌鱼;rxfp3.3a3基因在雄鱼的下丘脑和中脑的表达量都显著高于雌鱼。rxfp3和rxfp3.3b基因在脑分区中的表达量没有性别差异。因受体rxfp3.2a,rxfp3.3a3在罗非鱼雄鱼下丘脑中的表达量都高于雌鱼,推测中rln3基因在雄鱼中可能与受体rxfp3.2a,rxfp3.3a3结合,进而影响雄鱼的育性;且rln3a/3b基因在间脑中表达最高,而间脑和节律周期有关,推测该基因通过影响尼罗罗非鱼的昼夜节律进而影响罗非鱼的生殖。5、Rln3b对尼罗罗非鱼类固醇合成的影响。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功突变rln3b基因并建系至F1代。分析发现,rln3b突变系的3月龄雄鱼精巢无显著变化;6月龄精巢形态发生明显变化,出现透明囊泡,性腺指数GSI明显降低,精小叶形态由长条状变为不规则圆状,并且类固醇合成相关酶基因St AR1、cyp11a1、cyp17a1的表达量显著降低。综上所述,Rln3a通过c AMP/PKA信号通路影响雄激素合成,进而在尼罗罗非鱼的精子发生、成熟及育性过程中发挥重要作用。通过CRISPR/Cas9技术突变rln3b,发现Rln3b在罗非鱼精巢发育和类固醇合成过程中扮演着不可或缺的角色。本研究首次通过基因编辑,揭示Rln3在硬骨鱼类雄性生殖过程中的调控作用,为脊椎动物的生殖调控研究奠定了基础。