植物某些重要生态性状的变异性和可塑性对其响应气候变化具有非常重要的意义。例如,植物体可以通过选择吸收、结合钝化、代谢转化、改变代谢途径等方式对非生物和生物环境变化进行响应,但其实质都是植物通过调节代谢率和信号通路等相关基因的转录表达以适应各种环境胁迫。研究发现,DNA甲基化修饰作为一种保守的表观遗传标记在植物体的基因调控中起重要作用。目前在植物体内存在三种DNA甲基化修饰方式,即对称甲基化CG、甲基化CHG和甲基化CHH(H代表A、T、C)。其中,对称甲基化CG二核苷酸主要是通过它的识别蛋白MBD结构域蛋白发挥功能。经氨基酸序列比对,在拟南芥中已鉴定发现13个MBD蛋白,即AtMBD1-AtMBD13。前期研究表明,AtMBD5、AtMBD6和AtMBD7蛋白能够识别DNA甲基化修饰,且能够招募染色质重塑复合物、组蛋白脱乙酰酶和组蛋白甲基转移酶等,以调节基因的转录表达。AtMBD4和AtMBD11能够非特异性的识别对称甲基化CG二核苷酸、甲基化CHH和CHG DNA位点。AtMBD1、AtMBD2 和 AtMBD8 不具有识别 DNA 的能力,而 AtMBD3、AtMBD9、AtMBD10、AtMBD12和AtMBD13蛋白的MBD结构域功能至今尚未报道。目前动物体内的MBD蛋白已经进行大量研究,例如hMeCP2。hMeCP2蛋白的MBD结构域能够特异性识别对称甲基化CG二核苷酸。本论文以hMeCP2蛋白的MBD结构域和AtMBD蛋白的MBD结构域氨基酸进行序列比对,发现拟南芥MBD1、MBD2、MBD3、MBD4、MBD5、MBD6、MBD7 和 MBD12 结构域,具有hMeCP2蛋白识别甲基化CG DNA的保守氨基酸残基,而拟南芥MBD8、MBD9、MBD10、MBD11和MBD13结构域氨基酸序列不具有相同的保守性。比较分析氨基酸序列和前期实验报道,我们提出以下几个问题:AtMBD1-AtMBD13蛋白的MBD结构域是否具有识别甲基化修饰DNA的功能?其识别是否具有特异性?拟南芥MBD结构域蛋白识别DNA的结构机理是什么?本论文以上述问题为出发点,我们对AtMBD1-AtMBD13蛋白的MBD结构域蛋白进行了系统研究。首先通过基因重组方式,成功构建了 58个拟南芥MBD结构域蛋白表达载体,经表达纯化后,获得了 32个可溶性蛋白。除AtMBD1、AtMBD3和 AtMBD12 蛋白,我们分别获得了 AtMBD2、AtMBD4、AtMBD5、AtMBD6、AtMBD7、AtMBD8、AtMBD9、AtMBD10、AtMBD11 和 AtMBD13 蛋白的 MBD结构域可溶性蛋白。以此为基础,利用电泳迁移率实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和等温滴定量热法(Isothermal titration calorimetry,ITC)对这些拟南芥MBD结构域蛋白进行了 DNA底物识别特异性研究。实验结果表明,拟南芥MBD6结构域蛋白可以识别对称甲基化和半甲基化CG DNA;MBD4、MBD5和MBD7具有识别对称甲基化CG DNA的能力;但MBD2、MBD8、MBD9、MBD10、MBD11、MBD13没有检测到其识别底物DNA的能力。基于上述实验结果,利用核磁共振实验(Nuclear magnetic resonance,NMR)对AtMBD6和AtMBD11的MBD结构域蛋白质进行结构解析。虽然目前为止,还没有获得其结构,但AtMBD6和AtMBD11的MBD结构域蛋白的1H-15N HSQC图谱显示,其MBD结构域蛋白的稳定性和谱峰分散较好,可以做归属以及结合滴定实验,目前正在准备进行接下来的蛋白质结构解析实验。在本论文中,我们第一次利用纯化的单独MBD结构域蛋白,通过两种方法对10个拟南芥MBD结构域蛋白识别甲基化DNA的特异性进行了研究,我们期望能够解析具有不同识别特异性的MBD结构域的蛋白质结构,进一步说明它们识别DNA的结构机理。本论文的实验数据为进一步了解MBD蛋白识别DNA甲基化修饰在植物响应环境胁迫中的重要作用提供一定的线索。