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[目的]探讨galectin-9蛋白抗完全异基因小鼠心脏移植排斥的机制。[方法]构建含galectin-9基因的腺病毒,感染CHO细胞使其过表达galectin-9,免疫细胞化学和流式细胞染色确定其真核表达定位。以PMA+Ionomycin+BFA激活脾脏淋巴细胞,以流式细胞染色探讨活化前后CD4+淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞亚群表达galectin-9的平均荧光强度。原核表达并纯化基因重组人galectin-9蛋白。流式分选CD4+CD25-T细胞,体外诱导其向Th17细胞分化,加或不加galectin-9蛋白,检测诱导的CD4+IL-17+T细胞比例。胶原酶消化法分离完全异基因小鼠移植心内浸润淋巴细胞,分析CD4+Tim-3+T细胞和CD8+Tim-3+T细胞的比例以及天然免疫细胞Tim-3+的比例。构建小鼠BALB/c→C57BL/6心脏移植模型,予galectin-9蛋白短期干预,观察移植物存活情况,探讨不同组别移植物引流淋巴结和小鼠外周血内CD4+IFN-γ+、CD4+IL-17+、CD8+IFN-γ+, CD8+IL-17+, CD4+Tim-3+、CD4+Tim-1+淋巴细胞的比例。对比各组别移植受者脾脏内CD4+CD25+Foxp3+T细胞(Treg)的比例。[结果]galectin-9表达于CHO细胞的胞浆,galectin-9在活化的CD4+和CD8+淋巴细胞内胞浆有表达,可能以分泌形式发挥作用。在体外,galectin-9可抑制Th17细胞的生成。完全异基因移植心脏物浸润细胞内的Tim-3+淋巴细胞以CD8+细胞为主,CD8+Tim-3+淋巴细胞占CD8+淋巴细胞的比例达到40.5%±5.2%。给予galectin-9短期治疗可显著延长完全异基因小鼠移植心的存活时间(MST=23.0±1.0天vs对照组7.2±0.4天),移植物存活延长的同时伴随引流淋巴结内CD8+IFN-γ+、CD8+IL-17+和外周血中CD4+Tim-3+淋巴细胞比例下调,而CD4+Tim-1+比例上调,但galectin-9治疗组小鼠体内的Treg比例并无明显上调。[结论]Galectin-9在活化的CD4+T和CD8+T细胞胞浆内可检测到,可能通过分泌形式发挥免疫负反馈抑制作用。在体外,galectin-9可抑制Th17细胞的生成。galectin-9延长小鼠移植心的存活与CD8+T细胞免疫下调,Th1和Th17免疫受抑制(CD4+Tim-3+)而Th2免疫(CD4+Tim-1+)占优势有一定关联。[目的]探讨galectin-9促进DC成熟的效应,用Rapamycin在体外能否抑制galectin-9的促成熟效应。探索利用小剂量rapamycin和galectin-9能否诱导小鼠移植心耐受。[方法]分离BALB/c→C56BL/6排斥心脏内浸润细胞,流式检测圈定单核细胞/DC细胞亚群进行Tim-3的表达水平分析,Western Blot检测移植心内Tim-3L(galectin-9)的表达。体外培养BALB/c小鼠的BMDC,检测Tim-3的表达情况。以一定浓度梯度的galectin-9处理DC,或联合一定浓度梯度的Rapamycin检测DC表面共刺激分子CD80/CD86的表达。建立BALB/c→C56BL/6小鼠移植模型,按照以下处理进行分组：A.同基因对照组(C56BL/6→C56BL/6);B.异基因移植galectin-9单独治疗组；C.异基因移植Rapamycin治疗组；D. galectin-9+Rapamycin联合治疗组；E.异基因移植PBS治疗组。观察小鼠移植心存活情况。ELISPOT检测长期存活小鼠对供者抗原或非相关第三方抗原反应分泌IL-4和IFN-γ的情况。[结果]移植心内单核细胞/DC细胞Tim-3的阳性率高达47.3%±5.6%。移植后第3天galectin-9的表达水平显著上调,而第7天时表达减少。培养的不成熟BMDC组成性表达Tim-3,阳性率约为6.7%左右。使用galectin-9可促进DC细胞上调共刺激分子Cd80/CD86,而在联合使用Rapamycin后DC表达的共刺激分子水平明显减少。体内联合galectin-9和Rapamycin可促进全部移植物长期接受(>180天,n=6)；而单用galectin-9治疗,仅短期延长移植物存活(MST=23.5±2.2天)；单用rapamycin的治疗组,4例移植心在分别在移植后不同时间点被排斥,2例存活大于180天,与galectin-9联合Rapamycin使用组差异有统计学意义(p<0.05)。联合治疗组移植物长期受者对供者抗原刺激分泌IFN-γ和IL-4明显弱于第三方,获得针对供者抗原特异的免疫低反应。[结论]移植物内天然免疫细胞高表达Tim-3和移植心早期上调galectin-9,两者可能参与了移植排斥的发生。Galectin-9具有刺激DC成熟的作用,而Rapamycin可抑制galectin-9引起的DC成熟,两者联合使用可诱导移植心获得耐受。联合治疗的受者针对供者抗原产生显著减弱的Th1和Th2免疫反应。[目的]探讨ST2825作用于TLR信号关键接头蛋白MyD88以减轻小鼠异基因心脏移植排斥的机制。[方法]①GM-SCF+IL-4诱导BALB/c小鼠骨髓造血干细胞分化为DC,使用多种TLR配体及坏死心肌匀浆刺激其活化。检测ST2825抑制MyD88对DC表达共刺激分子CD80/CD86的影响。②分离C57BL/6小鼠淋巴结细胞(以T细胞为主),以BALB/c来源的DC刺激其增殖。加或不加CpG(TLR9配体),检测ST2825对混培体系中T细胞激活的影响。③行BALB/c→C57BL/6心脏移植,术前两小时给予250mg/kgST2825,以后每日给药1次直到术后第6天,第7日获取不同组别的移植心和脾脏,并留取7例观察移植心完全停跳时间。实时定量PCR检测移植心内促炎因子IL-1β,IL-6和TNF-α的mRNA水平,HE病理分析淋巴细胞浸润和心肌完整性,流式细胞仪检测移植受者脾脏内CD4+IL-17+和CD4+IFN-y+淋巴细胞以及CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例。[结果]体外使用ST2825可显著抑制各种TLR配体及坏死心肌匀浆刺激DC引起的CD80/CD86上调(除TLR3配体外),ST2825呈剂量依赖性抑制DC刺激的T细胞活化。单独使用ST2825显著延长小鼠心移植物存活时间(MST=19.4±0.98天vs 7.2±0.4天)。ST2825治疗组心肌结构较为完整,淋巴细胞浸润减少,移植物内的IL-1β和IL-6转录显著下调,CD4+IL-17+和CD4+IFN-γ+淋巴细胞比例亦显著下调,而CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例略上调。[结论] ST2825可显著显著延长小鼠同种异基因心移植物存活时间,与ST2825抑制DC活化,进而抑制T细胞活化并与CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的生成有关。[目的]探讨利用MyD88阻断剂ST2825阻断TLR信号,联合共刺激分子阻断剂anti-CD 154诱导皮肤移植耐受。[方法]建立BALB/c→C57BL/6小鼠皮肤移植模型,摸索ST2825阻断剂联合anti-CD 154体内给予的方案,观察移植皮片的存活时间。对移植皮肤长期存活的小鼠行ELISPOT检测对供者抗原的反应性：取受者脾细胞与供者脾细胞(BALB/c)或非相关第三方脾细胞(C3H)共孵育,检测IFN-γ和IL-4的斑点数。[结果]单独anti-CD 154干预组,单独ST2825干预组,CMC对照干预组异基因移植皮肤均不能获得保护,短期内即排斥。而联合使用anti-CD154+ST2825的治疗组,大多数皮肤移植物获得长期存活(>150天)。ELISPOT检测提示移植受者体内针对供者抗原呈现特异性低反应,脾细胞分泌IFN-γ的反应明显减弱,但分泌IL-4的反应保留。[结论]利用我们建立的anti-CD154+ST2825诱导方案可诱导完全异基因小鼠皮肤移植物长期接受。移植受者对供者抗原呈现特异性免疫低反应,可能与Th1免疫向Th2免疫偏移有关。