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本实验将Ang-2作为靶基因,成功构建Ang-2 RNA干扰(RNA Interference,简称RNAi)慢病毒载体,将其稳定转染人胶质瘤细胞株U251,研究其是否对胶质瘤细胞体内、外生长具有抑制作用及其机制。为此,我们进行了以下三部分实验研究。第一部分人促血管生成素-2(Ang-2)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体的构建和鉴定目的构建Ang-2基因RNAi慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据。方法合成Ang-2基因的miRNA干扰序列,构建pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR-Ang2质粒,测序验证插入序列完全正确,连接到慢病毒载体pLenti6/v5-Dest中,获得pLenti6/v5-Dest miRNA-Ang2质粒,与慢病毒包装质粒VIRAPOWER MIX、Lipofectamine 2000共转染293T细胞包装产生慢病毒颗粒,测定慢病毒滴度。结果PCR扩增和测序结果证实,Ang-2 miRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为8.26×107TU/ml。结论成功构建人Ang-2基因RNAi慢病毒载体,为研究其在胶质瘤细胞中的生物学功能和基因治疗奠定基础。第二部分促血管生成素-2(Ang-2)RNA干扰慢病毒表达载体稳定转染人胶质瘤细胞U251体外生长的抑制实验目的促血管生成素-2(Ang-2)RNA干扰慢病毒表达载体稳定转染人胶质瘤细胞U251后观察Ang-2、VEGF蛋白的表达,研究其对胶质瘤细胞U251体外生长的抑制作用。方法应用Ang-2 RNAi慢病毒载体、空载体分别转染体外培养的人胶质瘤细胞U251细胞株,以未转染组为对照,培养后,应用MTT法分析细胞生长抑制作用,ELISA检测Ang-2蛋白的表达,Western blot分析VEGF蛋白的表达。结果MTT检测表明Ang-2转染组U251细胞生长速度减慢,阳性转染组Ang-2及VEGF蛋白的表达较空载体组和对照组均明显减少。结论慢病毒载体对人胶质瘤U251细胞有着很高的感染效率,介导的RNAi可显著抑制靶基因的表达与活化,是对人胶质瘤细胞基因功能研究的理想工具。人胶质瘤细胞Ang-2基因受抑制后细胞生长显著变慢,其亦可能抑制VEGF的表达。第三部分促血管生成素-2(Ang-2)RNA干扰慢病毒表达载体稳定转染对人胶质瘤细胞U251成瘤性和血管生成的影响目的观察促血管生成素-2(Ang-2)RNA干扰慢病毒表达载体稳定转染对人胶质瘤细胞U251成瘤性和血管生成的影响。方法将Ang-2 RNAi慢病毒载体稳定转染人胶质瘤细胞U251。将24只裸鼠随机分为三组,分别用未转染的、转染Ang-2 RNAi慢病毒载体的、转染空载体的人胶质瘤细胞U251注射于裸鼠皮下产生肿瘤结节,观察肿瘤生成的速度并对肿瘤组织中的微血管进行检测。结果注射转染Ang-2 RNAi慢病毒载体的U251细胞的裸鼠肿瘤生长速度明显减慢,生长4周后肿瘤重量及肿瘤组织中血管生成的数量较未转染组和空载体组均明显减少(P<0.05)。结论Ang-2 RNAi慢病毒载体转染对人胶质瘤细胞U251成瘤性及其新生血管的生成有明显的抑制作用。Ang-2可能参与了胶质瘤的新生血管形成的过程。