【摘 要】
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[目 的]使用毕赤酵母表达SARS-CoV-2 S基因受体结合域,纯化后作为抗原免疫小鼠,制备杂交瘤细胞生产单抗,以期作为我所生产的灭活新冠疫苗的检测试剂。[方 法]将SARS-CoV-2 RBD基因交由华大基因进行人工合成并针对毕赤酵母进行密码子优化,合成的基因插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-RBD。将该质粒线性化后电转毕赤酵母,筛选重组的酵母单克隆并进行蛋白
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[目 的]使用毕赤酵母表达SARS-CoV-2 S基因受体结合域,纯化后作为抗原免疫小鼠,制备杂交瘤细胞生产单抗,以期作为我所生产的灭活新冠疫苗的检测试剂。[方 法]将SARS-CoV-2 RBD基因交由华大基因进行人工合成并针对毕赤酵母进行密码子优化,合成的基因插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-RBD。将该质粒线性化后电转毕赤酵母,筛选重组的酵母单克隆并进行蛋白表达,表达后的蛋白进行His标签亲和层析。将纯化后的重组蛋白免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,制备并筛选得到表达针对SARS-CoV-2 RBD特异性抗体的阳性杂交瘤细胞。[结 果]我们使用毕赤酵母成功表达出了 SARS-CoV-2 RBD蛋白,表达的重组蛋白大小为50kDa左右,重组蛋白于48h表达量最高。使用His标签亲和层析获得了高纯度的RBD蛋白,蛋白表达量达到了 0.7mg/L,浓缩后的蛋白浓度为7mg/L。使用重组的RBD蛋白免疫小鼠,小鼠血清中检测到了较高ELISA OD450值的抗体。进一步将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,使用HAT培养基进行2轮的克隆与亚克隆,获得2株能表达针对SARS-CoV-2 RBD特异性抗体的阳性杂交瘤细胞。[结 论]使用毕赤酵母成功表达出了 SARS-CoV-2 RBD蛋白。免疫小鼠后获得了 2株表达针对SARS-CoV-2 RBD特异性抗体的阳性杂交瘤细胞。生产的单抗可以作为我所生产的灭活新冠疫苗的检测试剂。
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