一.研究背景人巴贝西虫病,由顶复门(Apicomplexa)的巴贝西虫属(Babesia)原虫引起的红细胞内寄生性原虫疾病,主要经由携带巴贝西虫的媒介蜱叮咬传播。1888年,匈牙利生物学家Victor Babes在一头发热并伴有血尿的牛外周血中发现巴贝西虫,并以他的名字命名了该病原体。自1957年克罗地亚报道第一例人感染巴贝西虫病以来,越来越多的巴贝西虫病例被发现。目前,人类已经发现超过100种巴贝西虫可以感染野生动物或家畜,而其中只有近十种可以感染人类。巴贝西虫属于自然疫源性疾病,具有区域性流行特点。在对人致病的巴贝西虫中,根据形态学特征结合系统发育分析,可以概括为四类。代表种分别为:主要流行于美国绝大部分地区的微小巴贝西虫、引起美国散在病例的邓肯巴贝西虫、流行于欧洲的分歧巴贝西虫及猎户巴贝西虫,以及2007年韩国报道的一种大巴贝西虫(Babesia sp.“KO1”)。我国相关研究报道了蜱及动物中发现多种巴贝西虫,但绝大多数尚未发现对人致病的证据。国内目前只有散在的人感染巴贝西虫病例报道,包括浙江云南等地12例微小巴贝西虫病例、山东2例分歧巴贝西虫病例、新疆1例猎户巴贝西虫病例,以及山西、浙江及云南地区报道的14例未定种巴贝西虫感染病例。在这些病人中,有的病例复合感染了疟疾等其他传染病,重症患者也不断发生。巴贝西虫感染导致的疾病负担与日俱增,已成为一种“新的健康威胁”,其公共卫生重要性已越来越受到人们的关注。目前,国内关于巴贝西虫病人的研究均为被动的发现病例,巴贝西虫病在临床上远远还未被医生所认识和关注,经常导致误诊、漏诊。而且,在那些已经发现人感染病例的地区,宿主和媒介中感染的优势种及其分布往往不太一致;尤其是在诸多媒介蜱和宿主中已经发现携带的一些巴贝西虫种,是否可以对人致病?国内是否存在其他对人致病巴贝西虫?巴贝西虫流行区的优势基因型及其分布情况如何?巴贝西虫自然疫源地典型特征如何?等一系列问题尚无系统研究,但亟待解决。由于全国层面的人群巴贝西虫流行病学调查短时间内很难实现,所以,本研究拟选择有特征性的、蜱媒病复杂多样的东北地区作为着眼点,针对当地蜱咬风险较大、从事农业及林区作业的人群,依托哨点医院,开展人群巴贝西虫监测。对我国巴贝西虫病认识的提高和有效防控的实施,以及保护人民群众健康具有非常重要的意义。二、研究目的开展基于哨点医院的人巴贝西虫病的监测,旨在弄清该地区人群巴贝西虫的流行情况以及优势流行株,了解其病原学特征,掌握病例临床表现特点。同时,掌握当地媒介蜱、宿主中巴贝西虫的流行特征,了解疫源地特点,掌握传播及感染风险,并以此为依据,评估当地巴贝西虫对人群的威胁。三、研究方法2011年至2015年,每年5月至7月开展基于哨点医院(黑龙江省牡丹江林业中心医院)的巴贝西虫的主动监测,纳入在过去两个月内被蜱叮咬的病人,并通过问卷的形式来获得病人人口学信息及流行病学信息。病人临床信息则通过病案记录进行登记存档。以聚合酶链式反应(PCR)对病人进行初筛,并结合姬姆萨染色镜检,及联合重症免疫缺陷(SCID)小鼠接种分离病原体实验,确认巴贝西虫感染,并且以原位荧光杂交(FISH)实验作为辅助诊断。通过18S r RNA基因序列比对及系统进化分析对巴贝西虫进行定种。对于实验室检测阳性者,结合临床表现,使用美国国家CDC制定的巴贝西虫诊断标准,区分确诊病例和疑似病例。为探明相关细胞因子同巴贝西虫感染之间可能的关联,对病例血清细胞因子进行了检测。同时,对牡丹江周边林区的蜱及家畜中巴贝西虫进行同步调查,采用18S r RNA基因比对的方法确定巴贝西虫种。根据当地宿主动物、蜱中巴贝西虫流行情况评估巴贝西虫对当地人群的威胁。四、研究结果经过2011年至2015年五年的研究,共收集到3454份蜱咬病人外周血样本及病历资料。首次发现了东北地区存在两种巴贝西虫病流行,包括猎户巴贝西虫及一种新巴贝西虫(“Babesia sp.MDJ”)。首先,在2011-2014年的第一研究阶段,发现并报道了世界上最大的一簇猎户巴贝西虫病人,共48例。经18S r RNA基因短片段比对发现48例病例基因序列完全一致,并且同欧洲报道猎户巴贝西虫完全一致,表现出在不同生态系统下猎户巴贝西虫高度的保守性。18S r RNA基因全序比对也证明了这一点。姬姆萨染色镜检、原位荧光杂交实验及SCID小鼠接种分离病原体的方法进一步证实了猎户巴贝西虫感染。依据美国国家CDC制定的巴贝西虫诊断标准对48例病人进行分类诊断,其中32名为确诊病例,16例为疑似病例。在32例确诊病例中,21例(66%)表现出发热,13例(41%)伴有头痛,12例(38%)伴有肌肉痛或者关节痛,而3例(9%)伴有寒战。14例(44%)病人存在乏力,8名(25%)存在头昏,8例(25%)存在嗜睡表现。6名(19%)存在蜱叮咬处红斑,2位存在淋巴结肿大。分别有7位(22%)病人有贫血和4位(13%)血小板减少。14名确诊病人中7名病例出现转氨酶指标升高。相对对照组,确诊病例组的TNF-α(p<0.001)及VCAM-1(p<0.001)浓度均显著性升高,而PECAM-1(p<0.001)、P-selectin(p<0.001)及ICAM-3(p<0.001)浓度均显著性降低;疑似病例组的VCAM-1(p<0.001)浓度显著性升高,而PECAM-1(p<0.001)及ICAM-3(p<0.01)浓度均显著性降低。同时对牡丹江周边林区开展媒介蜱中巴贝西虫流行情况调查,发现牡丹江周边林区媒介蜱中存在6种巴贝西虫。全沟硬蜱(Ixodes persulcatus)中总感染率为1.77%,并且可以携带5种巴贝西虫,分别为猎户巴贝西虫、分歧巴贝西虫、微小巴贝西虫、双芽巴贝西虫(Babesia bigemina)及一种新巴贝西虫,我们暂时以牡丹江市首字母命名为“Babesia sp.MDJ”。嗜群血蜱(Haemaphysalis concinna)中巴贝西虫总体感染率为2.17%,有三种巴贝西虫共存,除双芽巴贝西虫及以上所述新巴贝西虫(“Babesia sp.MDJ”)外,还有一种未定种巴贝西虫,其与日本在浣熊中发现的巴贝西虫进化地位相近。针对上述全沟硬蜱及嗜群血蜱中发现的新巴贝西虫(“Babesia sp.MDJ”),对2015年哨点医院收集的542份蜱咬就诊病人外周血样进行筛查。共发现49例病例感染了“Babesia sp.MDJ”。经18S r RNA基因序列比对及系统进化分析,确认该巴贝西虫是一种新的对人致病巴贝西虫,并通过形态学观察确认“Babesia sp.MDJ”为一种大巴贝西虫。根据诊断标准,49例病例中的19例为确诊病例,其余30例为疑似病例。平均年龄51岁(4-72),其中37例(63%)为女性。全部患者均有蜱咬史,最常见的叮咬部位是头皮、耳朵及脖颈,也有少数叮咬于躯干及腹部。叮咬地点最常见的是林区,其次是农田及庭院。头晕(57.9%)、头疼(52.6%)及恶心(52.6%)是最为常见的症状。另外,有7例(36.8%)病例出现发热症状,有2例(10.5%)病例表现出肌痛。2例(10.5%)确诊病例及4例(13.3%)疑似病例出现淋巴结肿大。在收集到42份血清样本中,6例(14.3%)病例的转氨酶升高,而其中11例(26.2%)出现总胆红素水平升高。在牡丹江周边有针对性的对家畜中“Babesia sp.MDJ”感染情况进行调查,结果显示461只绵羊中有5只“Babesia sp.MDJ”阳性,并且基因序列比对显示人、蜱及绵羊中发现的“Babesia sp.MDJ”18S r RNA基因序列一致,而山羊、牛及鹿均为阴性,提示绵羊可能为“Babesia sp.MDJ”在当地的宿主动物,结合媒介蜱中巴贝西感染结果,确认了东北地区为“Babesia sp.MDJ”的自然疫源地。五、研究结论发现了世界上最大的一簇猎户巴贝西虫病例,并首次发现了一种新的可以对人致病的大巴贝西虫(“Babesia sp.MDJ”),并且两种巴贝西虫均可以感染健康人群;确认了东北地区是以上两种巴贝西虫病的流行区;证实了当地蜱中巴贝西虫多样性及复杂性;初步确定了新巴贝西虫“Babesia sp.MDJ”在当地的一种宿主动物——绵羊;确认了东北地区猎户巴贝西虫、“Babesia sp.MDJ”自然疫源地的存在。六、意义与创新性在世界范围内报道了最大的猎户巴贝西虫病例群,并且首次发现了一种全新的可以感染人体的大巴贝西虫(“Babesia sp.MDJ”),并首次发现以上两种巴贝西虫可以感染健康人群,为进一步研究巴贝西虫提供了重要依据。由于巴贝西虫病例常常表现出非特异性症状,所以在临床诊断方面常引起误诊。另外,根据本研究以及相关文献,可以认为,在中国巴贝西虫病分布应当非常广泛,随着巴贝西虫检测方法的发展及推广,那些先前被认为对人体不致病的巴贝西虫可能在不远的未来被证明是可以感染人。所以本研究进一步证实了巴贝西虫病远比人们想象的要普遍,这将有助于提高临床医生及公共卫生工作人员、蜱叮咬暴露人群对于巴贝西虫病的重视。本研究结果还证明了:巴贝西虫病不仅对免疫缺陷病人存在重要威胁,也同样威胁着免疫健全者。由于一方面,巴贝西虫亚临床病例及轻症病例本身可能在接受脾脏切除手术、接受免疫抑制药物治疗或罹患肿瘤等恶性疾病的情况下恶化为严重的甚至致命的巴贝西虫感染;另外一方面,亚临床病例及轻症感染者可能无意识的通过输血将巴贝西虫传染给受血者,由于需要输血的病人往往已经存在免疫低下或严重的基础疾病,所以对受血者,输血引起巴贝西虫感染往往后果更严重。本研究对于疫区的输血安全和潜在威胁也提供了科学预警。可以说,本研究结果从巴贝西虫流行地域、症状多样性、流行病学特、实验室特征、病原学等方面,加深了人们对巴贝西虫这种红细胞内寄生原虫的认识。该研究还对这种原虫的在相应蜱和宿主动物中流行情况进行了系统调查,首次确认了该病的自然疫源地。以上研究大大促进了我国蜱媒病疫区,尤其是传统的莱姆病、森林脑炎疫区,临床医生对这种新发血液原虫疾病特征的关注和了解,从而降低漏诊、误诊率,早期诊断,合理用药,也对我国巴贝西虫疫区的输血安全和潜在威胁提供科学预警,为蜱媒传染病相关研究提供了新的视野。