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背景：淋巴道转移是一个有众多相关分子参与的、由量变到质变的过程。这些转移相关分子构成了纷繁复杂的信号转导网络体系，一直以来都是肿瘤研究的的热点和难点。Hca–F和Hca–P是由本实验室自行建立的一对用于研究肿瘤淋巴道转移的细胞株。它们来自同一小鼠腹水肝癌细胞克隆的不同亚克隆，将两组细胞株经皮下注射至615小鼠足垫，特异性地向引流淋巴结转移，且二者之间淋巴道转移潜能显著不同，Hca–F为高淋巴道转移力细胞株，淋巴结转移率＞70%；Hca–P为低淋巴道转移力细胞株，淋巴结转移率＜30%。由于二者来源于同一亲本细胞系，遗传背景基本相同，差异主要集中于转移表型，因此这是一对研究肿瘤淋巴道转移机制的难得而有效的细胞模型。既往我们课题组通过抑制性消减杂交、基因芯片等高通量技术手段在mRNA水平筛选出了大量与肿瘤淋巴道转移相关的差异表达基因；又进一步利用荧光差异双向凝胶电泳和质谱分析,鉴定出163种与肿瘤淋巴道转移相关的差异表达蛋白质。其中包括：N末端c-jun激酶1（c-Jun N-terminal kinase1，Jnk1）、凝溶胶蛋白（Gelsolin，Gsn）和活化的蛋白激酶C受体1(receptor of activated C-kinase1，Rack1)，它们在Hca–F细胞中的表达均显著高于Hca–P细胞。Jnk1是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）超家族的重要成员之一，活化的Jnk1可通过调节c-Jun、c-myc的表达促进细胞增殖和调节细胞周期进程。Gsn是一种重要的骨架调节蛋白，在Ca2+依赖下调节细胞骨架actin的聚合和解聚，进而影响细胞的形态和运动。我们课题组经过体外、体内实验研究发现：Jnk1能够促进Hca–F细胞体外增殖、迁移和侵袭能力；Gsn具有促进Hca–F细胞体外侵袭、迁移能力和体内转移的作用。Rack1是分子量为36KD的胞内支架蛋白，可通过其WD40重复序列与多种信号分子（如：整合素、Src、PKC等）结合并相互作用，在多种重要生物反应中发挥了至关重要的作用。然而，Rack1对小鼠肝癌淋巴道转移细胞株生物学行为的影响、以及与其它淋巴道转移相关蛋白如何通过信号转导通路相互联系、相互作用之间的关系我们尚不清楚。肿瘤细胞从原发灶脱离向远处迁移是肿瘤转移所迈出的重要一步。粘着斑激酶（FAK）信号转导通路与肿瘤细胞的粘附、迁移、增殖密切相关。Rack1不仅参与了粘着斑复合物的形成并激活FAK，它还能与其它信号转导分子（如：PI3K、PKC等）相互作用，并在Ras-MAPK途径和PI3K-C-myc途径、JAK-STAT途径之间“交叉串话”。众所周知，Jnk1能够被Ras-MAPK信号激活。而Rac1在上皮细胞中可以受到PI3K的激活并促进Gsn的表达。因此我们推测，支架蛋白Rack1可能与FAK、PI3K相互作用，进一步调节Jnk1和Gsn的活性和表达，从而在小鼠肝癌淋巴道转移过程中发挥了一定作用。目的：1、构建pCDNA3.1(+)-Rack1基因过表达载体，稳定转染至小鼠肝癌低淋巴道转移细胞株Hca-P细胞中，得到Rack1基因表达明显上调的pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞株。2、研究Rack1基因表达上调的pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞株在细胞增殖能力、迁移能力、侵袭能力的变化，探讨Rack1基因表达对小鼠肝癌淋巴道转移细胞株细胞生物学行为的影响。3、研究Rack1基因表达上调后，pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞中Jnk1、Gsn、PI3K、Rac1基因的表达变化。4、研究PI3K抑制剂LY294002对pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞株体外增殖能力、迁移能力、侵袭能力的变化。5、研究PI3K抑制剂LY294002对pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞株Gsn、Jnk1、Rac1基因表达的影响。6、研究Rac1抑制剂NSC33766对pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞中Gsn基因表达的影响。方法：1、构建pCDNA3.1(+)-Rack1表达载体、pCDNA3.1(+)空载体阴性对照表达载体和pCDNA3.1(+)-GFP转染对照表达载体，分别用阳离子聚合物Sofast转染试剂转染至Hca-P细胞株，培养24小时后荧光显微镜下观察转染效率，用含400μg/ml G418的完全培养基筛选21天，获得稳定转染pCDNA3.1(+)-Rack1表达载体的pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞株和稳定转染pCDNA3.1(+)空载体阴性对照pCDNA3.1(+)-Hca-P细胞株。提取未处理的Hca-P细胞株、阴性对照pCDNA3.1(+)-Hca-P细胞株和pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞株的RNA和蛋白质，应用Real time qRT-PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白质水平检测Rack1基因的表达情况。2、应用CCK8试剂盒检测各组细胞增殖能力的变化；应用Transwell小室检测各组细胞迁移能力和侵袭能力的变化。3、收集pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞，空载体阴性对照pCDNA3.1(+)-Hca-P细胞及未处理的Hca-P细胞，提取蛋白并检测蛋白浓度，Western blot检测各组细胞中Jnk1、Gsn、PI3K、Rac1蛋白质表达变化。4、将pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞中加入不同浓度的PI3K抑制剂LY294002，利用CCK8试剂盒检测不同浓度的LY294002对pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞增殖能力的影响，并应用Transwell小室检测LY294002（40μM）预处理后pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞迁移能力和侵袭能力的变化。5、将pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞中给与不同浓度的PI3K抑制剂LY294002培养24小时后，提取蛋白并检测不同浓度LY294002预处理对pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞中Jnk1、Gsn、Rac1蛋白质表达的影响。6、在pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞中给予Rac1抑制剂NSC33766（50μM）预处理后培养24小时，Western blot检测NSC33766对pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞中Gsn蛋白质表达的影响。结果：1、重组质粒经酶切及测序分析，结果与Rack1基因序列完全相符，表明Rack1基因重组质粒构建成功。Real time qRT-PCR和Western blot结果验证，pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞中Rack1基因在mRNA和蛋白质表达水平相对空载体阴性对照pCDNA3.1(+)-Hca-P细胞及未处理的Hca-P细胞明显上调，可作为细胞生物学行为研究对象进行后续实验。2、CCK8检测细胞增殖能力实验结果显示pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞增殖OD值在培养48小时后明显上升，显著高于阴性对照组pCDNA3.1(+)-Hca-P细胞及未处理的Hca-P细胞（P<0.05），而阴性对照组pCDNA3.1(+)-Hca-P细胞及未处理的Hca-P细胞之间增殖能力无明显差异（P>0.05）； Transwell迁移和侵袭能力实验结果显示24小时pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞的迁移数及侵袭数较阴性对照组pCDNA3.1(+)-Hca-P细胞及未处理的Hca-P细胞均明显增加（P<0.05）。3、Rack1基因表达上调后， Western blot检测Gsn、 Jnk1、 Rac1蛋白表达在pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞中较阴性对照组pCDNA3.1(+)-Hca-P细胞及未处理的Hca-P细胞中显著增加（P<0.05）。4、给与不同浓度的PI3K抑制剂LY294002（0μM、5μM、10μM、20μM、40μM）处理后，CCK8试剂盒检测结果显示pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞增殖能力随LY294002浓度的增高而减低，各组间差异具有显著性（P<0.05）；给与LY294002（40μM）预处理后，pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞迁移、侵袭能力显著降低（P<0.05）。5、在pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞中给予不同浓度的LY294002（0μM、5μM、10μM、20μM、40μM）预处理后培养24小时，随着LY294002浓度的增高pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞中Gsn、Rac1蛋白表达量逐渐减低，而Jnk1蛋白表达量在LY294002浓度小于10μM时逐渐递减，当LY294002浓度大于20μM时则逐渐增加。6、在pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞中给予NSC33766（50μM）预处理后，pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞中Gsn的蛋白表达量显著降低。结论：1、成功构建了Rack1基因表达稳定上调的pCDNA3.1(+)-Rack1-Hca-P细胞株，为后续研究Rack1基因功能实验的细胞株。2、Rack1基因在Hca-P细胞中表达上调后，能够促进Hca-P细胞的体外增殖能力、迁移能力和侵袭能力，这一作用能够被PI3K抑制剂LY294002所抑制。3、Rack1基因在Hca-P细胞中表达上调后，促进Hca-P细胞中Jnk1、Gsn、Rac1蛋白表达增加。4、LY294002能够抑制Rack1基因表达上调后Hca-P细胞中Gsn、Rac1蛋白表达，并呈浓度梯度依赖性；LY294002在低浓度时可以抑制Jnk1的蛋白表达，高浓度的LY294002则可促进Jnk1的蛋白表达。5、Rac1抑制剂NSC33766能够抑制Rack1基因表达上调后Hca-P细胞中Gsn的蛋白表达。因此Rack1可能通过激活PI3K/Rac1信号通路并促进Jnk1和Gsn的表达来增强小鼠肝癌淋巴道转移细胞株的体外增殖、迁移和侵袭能力。