研究背景本课题的目的是依托磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)检测技术、为神经干细胞(neuroal stem cells, NSCs)移植治疗应用的疗效评估提供活体功能示踪技术方法。NSCs在神经创伤修复过程中具有重要学术价值,其中骨髓基质细胞来源的NSCs (bone marrow stroma cells-derived NSCs, BMSCs-D-NSCs),因其来源丰富、取材方便并可自体移植而不涉及免疫排斥及伦理问题等优势,具有广泛的临床应用前景。本研究团队在BMSCs-D-NSCs诱导分化及移植应用研究方面取得了乐观的前期实验结果,为进一步研究NSCs移植修复神经组织损伤的机制,还需要在细胞移植后的一定时间点对所移植NSCs在体内的功能情况进行评估。但迄今为止的各项技术(包括活体脑片膜片钳技术等),均未在研究NSCs移植后、于宿主脑内的功能评估方面获得突破；对于所移植细胞是否可与活体神经组织发生功能重组并发挥相关的功能尚无从确定。然而,BMSCs-D-NSCs活体内功能的鉴定和评估对于其移植治疗中枢神经系统(central nerve system,CNS)损伤修复策略的实施应用至关重要。根据本团队相关前期研究工作结果及前述内容的文献搜索,无论从形态结构、还是神经电生理神经生化的角度,都显示了NSCs在体外的确具备神经元样细胞分化的能力；近期发展起来并成为研究领域热切关注的诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS)技术,也从另一个侧面提示了干细胞(包括NSCs)向神经元方向发育分化并拥有相关神经元功能的确定性。这些前期工作的发现,都为我们进一步从事BMSCs-D-NSCs移植后的体内功能评估研究提供了有利依据,目前所需要的是一种更有效、更能直接活体评估移植NSCs在宿主体内功能重建的示踪方法。一般情况下,体外标记追踪方面,通常用绿荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)或5-溴-2’-脱氧尿苷(5-bromo-2’-deoxyuridine, BrdU)作为待移植NSCs或其DNA的标记物,经标本切片观察进行评估分析。但这种对以GFP或BrdU标记NSCs的追踪观察仅适用于体外分析或动物实验,而就NSCs活体内的分化及功能评估或未来临床疗效评估而言,探寻能直接评价移植NSCs在宿主体内功能重建的活性示踪方法更加重要。在从结构上活体示踪移植干细胞的存活迁移研究方面,国外曾有借用超顺磁氧化铁(Superparamagnetic iron oxide, SPIO)活体标记移植细胞修复心肌缺损评价的研究报道；本实验室则较早借助于SPIO活体标记手段对BMSCs-D-NSCs移植修复CNS损伤进行了研究,并取得乐观的前期实验结果。但这些标记物结合影像学活体示踪的内容还仅是从结构上追踪移植细胞的存活、迁移,无法从功能上追踪移植细胞在宿主神经组织内的功能状态。在从功能上活体评估和示踪移植干细胞与宿主组织功能整合与功效研究方面,研究报道尚属少见。以往采用的氟脱氧葡萄糖(fluorodeoxyglucose, FDG)正电子发射体层摄影(position emission tomography, PET)及血氧水平依赖(blood oxygen level-dependent, BOLD)磁共振(magnetic resonance imaging, MRI)成像方法只可提供区域脑组织活动的间接指标信息-脑局部糖代谢变化,尚难以直接反映神经活动变化,特别是尚无法在细胞水平上直接反映移植NSCs的功能活动。由此,本实验考虑应用活性诱导锰离子(Mn2+)增强的磁共振(manganese enhancement MRI, MEMRI)技术对NSCs移植后分化神经元功能评估。活性诱导的MEMRI功能成像技术成像机制为Mn2+的化学性质和离子半径与钙离子(Ca2+)相似,可以在神经刺激发生时通过开放的电压门控钙离子通道进入相应激活的核团或皮层,而Ca2+通道是参与突触活动和相关神经功能最主要的因素,因此Mn2+可以通过MRI形式实现对神经元功能活动的观察。经全身性氯化锰(MnCl2)给药并给予相关感觉刺激后,应用MRI可以观察到Mn2+在该感觉系统相应核团及皮层聚集。更有价值的是,Mn2+在神经功能活动发生时可以迅速进入激活的神经元,但是其在细胞内的清除期却较长。因此,通过延长神经刺激时间和药物维持时间,Mn2+可以在激活的神经元中持续增加聚集,这种Mn2+显像时程累积效应将有助于从数以千万计的移植细胞中捕捉到更细微、更瞬时的神经元电活动,这也是该技术不同于既往的BOLD fMRI及活体脑片膜片钳技术的优势所在,适用于移植NSCs分化为功能性神经元后数量及功能活动少、且表现为瞬时状态的特点。但是Mn2+增强功能成像技术仍处于发展阶段,仍存在很多方法学上的问题。首先,Mn2+的毒性问题是困扰NSCs移植后分化神经元功能评估的重要影响因素之一。Mn2+具有急性和慢性的毒性作用。在MEMRI动物试验中,急性毒性作用尤其不容忽视。其急性毒性主要表现在对心肌的作用,机制在于Mn2+可依赖于不同剂量而对Ca2+通道起到激活或阻滞的双重作用,不同给药剂量、给药途径和速度可以在不同程度上起到抑制心肌电传递系统的作用。既往的MEMRI功能成像试验中,应用的Mn2+剂量相对较高,并不适合于NSCs移植后分化神经元的功能评估所需条件。因而通过各种方法降低该成像方法中应用的Mn2+剂量是必需和首要的步骤,也是本研究着重关注的内容之一其次,MEMRI应用T1加权序列信号强度作为反映Mn2+聚集浓度的指标。虽然既往的研究显示活体内的Mn2+浓度变化与T1弛豫时间具有线性关系,然而T1加权信号强度不仅受到T1弛豫时间的影响,同时也会受到T2弛豫时间的影响。因此T1加权信号强度仅在一定Mn2+浓度范围内与其浓度成线性关系,这就需要对皮层的Mn2+浓度进行化学测量,从而进一步支持影像学结果,这种化学测量的方法研究也是必要的。本实验从电感耦合等离子体质谱分析方法的角度初步探索了支持影像学结果的化学检测方法。此外,MEMRI数据处理过程亦需完善,因该成像方法目前为止尚缺少统一的数据处理方法规程。本研究尝试运用图像配准后平均化、数字减影及兴趣区信号强度统计分析的方法,期望初步形成一套适用于影像学数据处理的方法规程。总体而言,面向NSCs移植后分化神经元样细胞的活体功能评估,需要一套成熟有效的MEMRI功能成像方法。本课题目的即在于优化MEMRI脑功能成像技术。其中最主要的方面在于,通过方法的改进减少应用于MEMRI功能成像技术中的Mn2+剂量,建立支持影像学结果的化学检测方法,以及建立合适的影像学数据处理方法规程。旨在通过以上实验研究,初步建立一套较为成熟的、适合NSCs移植后分化神经元样细胞活体功能评估的成像及检测方案。第一部分大鼠原代皮层神经元锰离子增强磁共振功能成像目的：初探锰标记神经细胞功能活动的可行性,并初步探索以MEMRI成像评估NSCs移植后分化神经元功能的细胞浓度与锰浓度。要进行NSCs移植分化神经元的MEMRI功能评估,就需要对神经元的锰吸收能力及成像的可行性及特性有一定认识,需要了解多大浓度的神经元在多大浓度的锰离子干预下可以有效获得增强成像的结果,该浓度的Mn2+对神经元存活的影响也在考虑范围之内。为此,我们进行了原代培养大鼠皮层神经元体外MEMRI成像初步研究,希望通过该前期研究,了解大鼠皮层神经元对Mn2+的吸收能力、达到磁共振成像要求的条件、及其成像特点,为NSCs移植后、在中枢神经组织内分化的神经元功能成像实验提供依据,也便于后续实验中选择合适数量的移植细胞及合适的Mn2+对比剂剂量。方法：原代皮层神经元培养及鉴定按常规方法进行。原代培养的皮层神经元分为“无锰干预对照组”及“MnCl2干预组”。MnCl2干预组又按添加MnCl2终浓度的不同而分为各浓度亚组(氯化锰干预组的各亚组,分别添加终浓度为0.05mMol/L、0.1 mMol/L、0.2mMol/L、0.5 mMol/L的MnCl2);无锰干预对照组则不添加MnCl2。添加MnCl2后24小时进行MTT检测,以观察不同浓度MnCl2对细胞存活率的影响。另设与以上相同组在添加MnCl2后,进行谷氨酸刺激,其中0.5 mMol/L MnCl2干预亚组设1个不进行谷氨酸刺激的对照,各组添加谷氨酸的终浓度为10μMol/L,经MnCl2及谷氨酸双重干预后24小时24小时、再以电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)检测细胞内的锰含量,并进行细胞磁共振成像实验。数据资料统计分析应用SPSS13.0软件；计量资料的统计分析应用单因素方差分析,组间两两比较应用最小显著差法(the least significant difference, LSD);统计水准α=0.05。结果：原代培养大鼠皮层神经元生长状态良好,神经元微管相关蛋白2(microtubule-associated protein, MAP-2)及Hochest33342双染阳性。MTT结果中,方差齐性检验显示对照组及四个浓度锰标记组神经元存活量测定方差齐性(Levene statistic=1.410, P=0.260),该五组神经元存活量差异具有显著性(F=162.696,P=0.000),应用LSD法两两比较显示,四个浓度锰标记组与对照组比较神经元存活量差异均具有显著性(tab=18.508, Pab=0.000; tac=17.518, Pac=0.000; tad=21.340, Pad=0.000; tae=21.698, Pae=0.000),四个浓度的MnCl2标记组神经元存活量均低于对照组；0.2mMol/L、0.5mMol/L MnCl2标记组神经元存活量与0.05mMol/L、0.1mMol/L MnCl2标记组神经元存活量比较差异具有显著性(tbd=2.833, Pbd=0.009; tbe=3.190, Pbe=0.004; tcd=3.823, Pcd=0.001; tce=4.180, Pce=0.000),0.2mM、0.5mM MnCl2标记组神经元存活量低于0.05mMol/L、0.1mM ol/LMnCl2标记组；0.2mMol/L与0.5mMol/L MnCl2标记组之间的神经元存活量比较差异无显著性(tde=0.358, Pde=0.724),0.05mMol/L与0.1mMol/LMnCl2标记组之间的神经元存活量比较差异亦无显著性(tbc=-0.990, Pbc=0.332)。ICP-MS锰含量分析显示,随着标记锰浓度的增高,神经元内锰含量也增高,加谷氨酸刺激组细胞内锰含量(840ppm)高于无谷氨酸刺激组(140ppm)。不同浓度锰标记细胞磁共振图像显示,0.1mMol/L、0.2mMol/L及0.5mMol/L MnCl2标记组的磁共振信号强度有明显增高,而且随着标记锰浓度的增高,磁共振T1加权序列信号强度也增加；0.5mMol/L MnCl2标记组信号强度高于0.5mMol/L无谷氨酸刺激组。结论及意义：1、体外证实了锰标记神经细胞功能活动可行性,并初步建立了MEMR体外培养细胞功能成像及化学测定细胞内锰含量的技术方法。2、一定程度上提示了应用MRMRI对移植NSCs分化神经元进行功能成像的可行性,为下步MEMR成像NSCs移植后分化神经元功能评估提供了可参照的细胞浓度与锰浓度。实验中,应用106/ml神经元进行成像实验,且需0.1mMol/L MnCl2才可获得较明显的磁共振增强效果,提示进行NSCs移植功能追踪实验时,移植细胞在体内浓度应高于106/ml,从而使实验中可明显增强MRI的可选浓度小于0.1mMol/L MnCl2。第二部分：低剂量氯化锰大鼠视觉皮层磁共振功能成像目的：除了MnCl2对神经元活性的直接影响,后续的NSCs移植后分化神经元活体内功能追踪实验还需要注意的是,活体给予MnCl2时,MnCl2对大鼠的全身急性毒性作用。本实验目的在于探寻体内实验中通过延长刺激时间充分发挥注射锰作用的方法,从而降低活体MEMRI实验中所需锰量,减少其急性毒性作用,以利今后NSCs移植后分化神经元活体内功能评估。近期的MEMRI大鼠视觉皮层功能成像研究中,所应用的MnC12剂量多为33mg/kg,且其增强差异效果需采用板层分析才能检测到。课题组在既往研究中发现,Mn2+在血脑屏障(blood brain barrier, BBB)关闭以后,仍存在着持续进入脑功能激活区的提示。本实验目的即在于,研究锰成像过程中是否确实同步存在着Mn2+向激活区脑组织的迁移,从而通过在BBB关闭后延长刺激时间的方法,充分利用以低剂量注射的锰、从而减少锰的总应用量。方法：成年雄性Wistar大鼠(N=24只)均分为四组：视觉刺激组、无刺激组、半刺激组、静脉注锰组。应用36mg/ml水合氯醛按360mg/kg腹腔注射麻醉,麻醉生效后进行右侧颈外动脉插管用于注射药物。各组均在进行30%甘露醇7mg/kg右侧颈外动脉注射以开放BBB后进行MnCl2给药,其中视觉刺激组、无刺激组及半刺激组均由右侧颈外动脉插管注射MnCl2,静脉给锰组由尾静脉注射MnCl2,用量均为5mg/kg。之后给予视觉刺激。各组视觉刺激处理如下：视觉刺激组大鼠放置于视觉刺激装置中进行视觉刺激5小时；无刺激大鼠放置于暗室中静置5小时；半刺激组大鼠先在视觉刺激装置中进行刺激2小时再转至暗室中静置3小时；静脉给锰组则先于暗室中静置2小时再转至视觉刺激装置中刺激3小时。刺激后即进行磁共振数据获取。获取MEMRI图像后处死大鼠取脑,应用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)仪进行视觉皮层锰含量定量分析；应用Matrix Laboratory (MATLB)、Statistical Parametric Mapping (SPM)、MRIcro软件进行图像后处理,过程主要包括图像配准、组内图像平均化、图像减影及兴趣区分析。数据资料统计分析应用SPSS13.0软件；计量资料的统计分析应用单因素方差分析,方差不齐时组间差异比较应用Welch法,组间两两比较方差齐性时应用LSD法,方差不齐时应用Tamhane法；统计水准α=0.05。结果：(1)由平均化的T1加权像可观察到：视觉刺激组、无刺激组及半刺激组均可呈现注射甘露醇破坏BBB的右侧半球信号增强高于左侧半球；静脉给锰组未观察到明显的皮层信号增强,仅有微弱的双侧深部脑结构增强；视觉刺激组的皮层信号增强主要位于右侧视觉皮层；半刺激组的皮层信号增强位于右侧视觉皮层及部分非视觉皮层,非视觉结构信号增强并没有集中在特异性的脑功能区；无刺激组的皮层信号增强则呈现广泛化,没有观察到特异性的集中。(2)由像素基础的图像减影可以观察到：视觉刺激组中与视觉刺激相关的主要信号增强区为视觉皮层；半刺激组中除了视觉皮层信号增强外,也有一些与视觉皮层无关的非特异性信号增强区,这些非特异性增强区域没有指向特定的功能区。(3)数据处理与分析：兴趣区分析方差齐性检验显示,三组视觉皮层标准化信号强度方差齐性(Levene statistic=2.151, P=0.151);单因素方差分析,三组视觉皮层标准化信号强度差异具有显著性(F=15.539,P=0.000)；应用LSD法两两比较显示,任两组比较差异均具有显著性(tab=-2.594, abp=0.020; tac=-5.570, acp=0.000; tbc=-2.977, bcp=0.009),其中视觉刺激组及半刺激组的右侧视觉皮层标准化信号强度高于无刺激组(abp=0.020；acp=0.000),视觉刺激组信号强度高于半刺激组(bcp=0.009)。右侧视觉皮层锰含量分析支持了兴趣区分析结果,方差齐性检验显示三组视觉皮层锰含量方差不齐(Levene statistic=7.260, P=0.006),方差分析应用Welch法检验显示三组视觉皮层锰含量差异具有显著性(Welch statistic=104.284,P=0.000),应用Tamhane法两两比较显示任两组比较差异均具有显著性(abp=0.040；acp=0.000；bcp=0.029),其中视觉刺激组及半刺激组的视觉皮层锰含量高于无刺激组(abp=0.000；acp=0.040),视觉刺激组视觉皮层锰含量高于半刺激组(bcp=0.029)。结论及意义：1本实验条件下,应用既往文献所报道的1/6量Mn2+即可获得更高强度的信号差异。2开放BBB后, Mn2+大量入脑,进入不同区域的Mn2+可以在BBB关闭后持续进入激活区。3以往认为开放BBB的作用是便于Mn2+透过开放的BBB直接进入受刺激皮层；本实验提示BBB开放的另一作用是便于Mn2+透过开放的BBB进入脑内非受刺激区或脑脊液,由此这些Mn2+可以在BBB关闭后仍能持续进入受刺激皮层。Mn2+这种通过BBB后的迁移过程将有利于减轻血管内注药而导致的血流动力学干扰。4应用ICP-MS补充证实了成像信号与锰浓度关系,在一定程度上弥补了信号强度与锰浓度非线性关系的不足。第三部分：经鼻腔给药的锰离子增强视觉皮层磁共振功能成像目的：探寻能够绕过BBB而使锰离子发挥脑内成像作用的方法。由于以上应用的方法仍有部分不足(表现为BBB是Mn2+进入脑内的最大障碍,颈动脉插管仍是有创操作,凝血问题不利于多次成像等),结合以往神经传导通路成像研究表明的“Mn2+可通过嗅觉通路进入嗅球,而嗅球是大鼠脑内缺乏BBB区”这一结论,本实验考虑通过鼻腔给药,使锰首先通过神经通路进入嗅球,再通过嗅球分布到脑功能激活区,从而绕过BBB实现脑的功能成像。方法：成年雄性Wistar大鼠(N=12只)分为两组：完整嗅球组、嗅球切除组。实验前,嗅球切除组切除双侧嗅球,完整嗅球组则不做切除处理。应用2%异氟烷吸入麻醉后,进行MnCl2给药,各组均由鼻腔插管注射MnCl2, MnCl2浓度为3mol/L,每侧鼻腔注射5μ1。两组同时进行视觉和嗅觉双刺激,其中视觉刺激同第二部分方法,嗅觉刺激则采用Paulter法、以缓慢挥发的醋酸戊酯进行嗅觉刺激,持续进行20小时。获取MEMRI图像及后处理方法同第一部分研究,。数据资料统计分析应用SPSS13.0软件；计量资料的统计分析应用t检验分析,统计水准α=0.05。结果：(1)由平均化的T1加权像可观察到：完整嗅球组嗅球的MRI信号明显增强；而嗅球切除组,本应嗅球对应的脑功能区域无信号增强；视觉皮层冠状面上,完整嗅球组也有视觉皮层MRI信号的增强,同时呈深部脑结构MRI信号的轻微增强；而嗅球切除组同样有深部脑结构MRI信号的轻微增强,但却没有发现皮层MRI信号的增强。(2)由像素基础的图像减影可以观察到：完整嗅球组中,与嗅球存在相关的主要增强区为视觉皮层。(3)数据处理与分析：兴趣区分析中方差齐性检验显示完整嗅球组与嗅球切除组视觉皮层信号强度方差齐性(F=3.199,P=0.104)；t检验显示,完整嗅球组与嗅球切除组视觉皮层信号强度差异具有显著性(t=3.973,P=0.003),完整嗅球组的视觉皮层信号强度高于嗅球切除组。视觉皮层锰含量分析亦支持兴趣区分析的结果,方差齐性检验显示完整嗅球组与嗅球切除组视觉皮层锰含量方差齐性(F=0.190,P=0.672)；t检验显示完整嗅球组与嗅球切除组视觉皮层锰含量差异具有显著性(t=-2.696,P=0.022),完整嗅球组视觉皮层锰含量高于嗅球切除组。结论及意义：1、鼻腔给药可以无创性地绕过BBB进行视觉皮层功能成像；2、嗅觉刺激对MEMRI成像的信号增强起有重要的正性调控作用。第四部分：重复经颅磁刺激锰离子增强磁共振功能成像目的：进一步验证动脉给药MEMRI成像方法。第二部分实验证实,在激活视觉皮层的情况下,通过开放BBB并延长刺激时间的方法,可以应用低剂量MnCl2获得更高的目标皮层信号强度改变。因第二部分实验方法获得的功能皮层磁共振锰增强信号较第三部分实验即经鼻腔给药的MEMRI方法更明显,所以适合于NSCs移植后微弱的功能测定,为进一步验证该方法也适用于其他脑区激活的情况,进行了本实验,即通过重复经颅磁刺激(repetitive transcranial magneticstimulation, rTMS)全脑激活,应用MEMRI观察其他脑区的激活情况,同时也为rTMS提供新的影像学研究方法。方法：成年雄性Wistar大鼠(N=18只)均分为三组：高频磁刺激组、低频磁刺激组、假刺激组。首先应用36mg/ml水合氯醛按360mg/kg腹腔注射麻醉,麻醉生效后、进行右侧颈外动脉插管用于注射药物。各组均在进行30%甘露醇右侧颈外动脉注射(7mg/kg)、开放BBB后给予MnCl2 (5mg/kg),之后放于固定装置中行rTMS,高频刺激频率设置为10Hz、250次持续刺激、每次持续刺激时间1s、间隔时间79s,刺激结束时共接受2250个刺激脉冲,低频设置为1Hz、750次持续刺激、每次持续刺激时间3s、间隔时间21s,刺激结束时共接受2250个刺激脉冲。假刺激组大鼠同样放置于固定装置中5小时,但将线圈与颅骨成90。角放置,从而使磁场远离鼠脑、仅提供与高频或磁刺激同样的磁场噪音。磁共振数据的获取在给锰和磁刺激5小时后进行。获取MEMRI图像及后处理同第一部分研究。数据资料统计分析应用SPSS13.0软件；计量资料的统计分析应用单因素方差分析,组间两两比较应用LSD法；统计水准α=0.05。结果：(1)由平均化的T1加权像可观察到：假刺激组、高频磁刺激组及低频磁刺激组,在注射甘露醇破坏BBB的右侧半球,信号增强均高于左侧半球；高频磁刺激组,全脑冠状层面的右侧皮层均有信号增强；低频磁刺激组的皮层信号增强,分布在包含运动感觉皮层的冠状层面右侧；假刺激组则未出现特异性皮层信号增强情况。(2)由像素基础的图像减影可以观察到：高频磁刺激组中,与磁刺激相关的主要信号增强区为嗅球、包含运动感觉视觉区的冠状层面右侧皮层、右侧下丘；低频刺激组中,与磁刺激相关的主要增强区为包含运动感觉区的冠状层面右侧皮层及右侧下丘。(3)数据处理与分析：兴趣区分析中,方差齐性检验显示,三组右侧运动皮层标准化信号强度方差齐性(Levene statistic =1.733, P=0.210);单因素方差分析,三组右侧运动皮层标准化信号强度差异具有显著性(F=28.533,P=0.000)；应用LSD法两两比较显示,任两组右侧运动皮层标准化信号强度比较差异均具有显著性(tab=-7.505, abp=0.000; tac=-4.500, acp=0.000; tbc=3.006, bcp=0.009),其中高频磁刺激组及低频磁刺激组右侧运动皮层标准化信号强度高于假刺激组(abp=0.000；acp=0.000),高频磁刺激组信号强度高于低频磁刺激组(bcp=0.009)。运动皮层锰含量分析也支持了这些有关兴趣区的分析结果,方差齐性检验显示,三组运动皮层锰含量方差齐性(Levene statistic=3.575, P=0.054);单因素方差分析三组运动皮层锰含量,差异具有显著性(F=44.680,P=0.000)；应用LSD法两两比较显示,任两组比较运动皮层锰含量差异均具有显著性(tab=-9.295,abp=0.000；tac=3.156,acp=0.007；tbc=6.139,bcp=0.000),其中高频刺激组及低频刺激组运动皮层锰含量高于假刺激组(abp=0.000；acp=0.007),高频刺激组运动皮层锰含量高于低频刺激组(bcp=0.000)结论及意义：1、MEMRI功能成像方法不仅适用于视觉皮层功能成像,也可以应用于rTMS研究；2、本实验提供了一个可用于rTMS治疗及机制研究的新rTMS动物模型；3、佐证高频磁刺激可提高局部脑活性、而低频降低脑活性。4、高频刺激可以获得更广泛的激活区。