孕期母体镉暴露与胎儿生长受限(fetal growth restriction,FGR)的关联尚存在争议。本课题拟用实验室前期建立的中国安徽出生队列研究(China-Anhui Birth Cohort Study,C-ABCS)平台,以合肥出生队列3352对单胎母婴为样本人群,分析孕期不同阶段镉暴露分别与低出生体重(low birth weight,LBW)和小于胎龄儿(small for gestational age,SGA)的关联强度;在成功建立镉诱导胎鼠生长受限的孕鼠模型基础上,观察镉在母体、胎盘和胎体内的分布和代谢情况以及对胎盘结构与功能的损害效应;探讨孕期镉暴露对小鼠胎盘内质网应激的调控作用,并进一步研究镉对人胎盘滋养细胞内质网应激的调控作用;研究自由基清除剂N-叔丁基-α-苯基硝酮(N-tert-butyl-α-phenylnitrone,PBN)对镉诱导胎盘内质网应激的拮抗效应,以阐明活性氧在镉诱导胎盘内质网应激中的作用;探讨IRE1小干扰RNA(small interfering RNAs,si RNAs)转染对镉下调胎盘滋养细胞生长因子和营养物质转运泵表达的拮抗效应,以阐明内质网肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)信号通路在镉损害人胎盘滋养细胞功能中的作用。本研究为最终阐明孕期母体镉暴露引起胎儿生长受限的分子机制提供科学依据。第一部分:孕期镉暴露与胎儿生长受限(FGR)关联的人群研究目的:探讨孕期不同阶段镉暴露分别与低出生体重(LBW)和小于胎龄儿(SGA)的关联强度。方法:本研究从C-ABCS中选择合肥出生队列,抽取该队列已经收集的3352例孕妇和新生儿出生资料、孕妇血清标本,用石墨炉原子吸收分光光度法检测孕妇血清镉含量。结果:镉检测结果显示,该队列孕妇平均血清镉含量为0.89mg/L。按照孕妇血清镉含量≥P75分为高镉组,而血清镉含量<P75低镉组,分析孕期不同阶段母体高镉暴露引起LBW和SGA发生的RR及其95%CI。整个孕期3352例孕妇资料分析结果表明,孕期高镉暴露组新生儿LBW发生率为4.3%(RR为2.25;95%CI:1.45,3.49;P<0.001),在控制孕期BMI、孕妇年龄、月平均收入和孕妇血清采集时间等变量后,高镉暴露诱导新生儿发生LBW的RR为2.21(95%CI:1.43,3.42;P<0.001);孕期高镉暴露组SGA发生率为10.5%(RR为1.43;95%CI:1.09,1.86;P=0.009),调整RR为1.41(95%CI:1.08,1.85;P=0.011)。孕早期1122例孕妇资料分析结果显示,孕早期高镉暴露组新生儿LBW发生率为2.5%(RR为1.26;95%CI:0.52,3.08;P=0.608),在控制孕期BMI、孕妇年龄和月平均收入等变量后,高镉暴露诱导新生儿发生LBW的RR为1.26(95%CI:0.52,3.08;P=0.606);孕早期高镉暴露组SGA发生率为9.4%(RR为1.20;95%CI:0.75,1.93;P=0.446),调整RR为1.18(95%CI:0.73,1.90;P=0.498)。孕中晚期2230例孕妇资料分析结果显示,孕中晚期高镉暴露组新生儿LBW发生率为5.2%(RR为2.70;95%CI:1.63,4.49;P<0.001),在控制孕期BMI、孕妇年龄和月平均收入等变量后,高镉暴露诱导新生儿发生LBW的RR为2.79(95%CI:1.68,4.66;P<0.001);孕中晚期高镉暴露组SGA发生率为11.1%(RR为1.55;95%CI:1.12,2.13;P=0.008),调整RR为1.54(95%CI:1.11,2.12;P=0.009)。结论:孕中晚期母体高镉暴露显著升高LBW和SGA发生风险。第二部分:孕期镉暴露损害胎鼠发育和胎盘结构与功能的动物实验研究目的:探讨孕期镉暴露对胎鼠发育和胎盘结构与功能的损害作用。方法:本研究由3个实验组成。实验1,本研究采用两种方法建立胎儿生长受限的孕鼠模型,一种方法是受孕第9天(gestational day 9,GD9)小鼠经腹腔单次给予氯化镉(4.5 mg/kg)溶液,另一种方法是受孕第13天至17天(GD13-17)小鼠每日上午经腹腔注射单次给予氯化镉(0.5 mg/kg)溶液。两种方法均于GD18早晨剖杀孕鼠,然后测量胎鼠身长和重量。实验2,为了探讨孕期母体镉暴露对母体、胎盘和胎体镉分布的近期和远期影响,受孕第9天小鼠被腹腔单次给予氯化镉(4.5mg/kg),GD10和GD18分别剖杀孕鼠,收集母鼠(血清、肝脏和肾脏)、胎盘和胎鼠相关标本,用石墨炉原子吸收分光光度法检测样品镉含量。实验3,为了探讨孕期母体镉暴露对小鼠胎盘结构与功能的影响,受孕第9天小鼠被单次腹腔注射NS或氯化镉(4.5 mg/kg),于GD10和GD18分别收集小鼠胎盘。GD18小鼠胎盘被称重和测量胎盘直径,GD10和GD18部分胎盘固定后做组织病理学检查,部分胎盘提取RNA行定量PCR检测。结果:实验1结果显示,孕中期单次镉暴露或孕晚期多次镉暴露均明显降低胎鼠身长和体重,而母鼠无明显中毒体征。这提示,孕期母体镉暴露诱导胎鼠生长受限。实验2结果发现,GD9小鼠被镉处理后,GD10母鼠血清、肝脏和肾脏镉含量分别升高2.8、80.5和13.4倍,GD10胎盘和胚胎分别升高60.2和11.5倍;GD18母鼠血清、肝脏和肾脏镉含量分别升高2.2、300.9和34.3倍,GD18胎盘和胚胎分别升高47.4和4.9倍,而GD18胎鼠血清镉含量无变化。这些研究结果充分提示,进入母体的镉在胎盘组织蓄积,仅有少量镉透过胎盘屏障进入胎鼠体内。实验3结果表明,孕期镉暴露明显减轻小鼠胎盘重量和降低胎盘直径。HE染色结果显示,孕期母体镉暴露明显减少胎盘迷路层平均血窦区面积;TUNEL染色和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)免疫染色结果表明,孕期母体镉暴露明显促进胎盘细胞凋亡和抑制胎盘细胞增殖。定量RT-PCR结果发现,孕期母体镉暴露明显下调小鼠胎盘营养物质转运泵(Glut1、Znt1、Zip1和Pcft)、生长因子及其受体(Pgf、Igf2、Vegfr1和Igf2r)m RNA表达。这些结果提示,孕期母体镉暴露明显引起小鼠胎盘结构与功能障碍。结论:孕期母体镉暴露引起胎盘镉蓄积,导致胎盘结构与功能障碍,并诱发胎鼠生长受限。第三部分:内质网IRE1信号在镉损害胎盘滋养细胞功能中的作用及其机制研究目的:探讨活性氧在镉诱发胎盘内质网应激中的作用和内质网IRE1信号在镉损害胎盘功能中的作用。方法:本实验由3个实验组成。实验1,为了探讨镉对小鼠胎盘内质网应激和未折叠蛋白反应的影响,受孕第9天小鼠被单次氯化镉(4.5 mg/kg),于镉处理后0、2、8和24 h收集小鼠胎盘,分别检测不同时点小鼠胎盘组织内质网应激和未折叠蛋白反应相关基因与蛋白的表达情况。实验2,为了探讨活性氧在镉诱导胎盘内质网应激中的调控作用,受孕第9天小鼠在氯化镉(4.5 mg/kg,i.p.)处理前0.5 h和处理后4 h给予PBN(100 mg/kg,i.p.),于镉处理后8和24 h收集小鼠胎盘,检测胎盘氧化应激和内质网应激相关指标。实验3,为了探讨未折叠蛋白反应下游IRE-1a信号通路在镉下调胎盘滋养细胞营养物质转运泵和生长因子表达中的作用,人JEG-3细胞在镉处理前转染IRE-1 si RNAs,于镉处理后12 h收获细胞,用定量RT-PCR技术检测营养物质转运泵和生长因子m RNA表达。结果:实验1结果显示,孕期母体镉暴露明显上调小鼠胎盘内质网应激和未折叠蛋白反应相关基因(Grp78和Atf4)m RNA及相关蛋白(GRP78,pe IF2a和CHOP)表达。细胞实验还发现,不同浓度的镉显著上调胎盘滋养细胞内质网应激和未折叠蛋白反应相关蛋白(p IRE1a、pe IF2a、CHOP、p JNK和GRP78)表达,但存在时间效应,镉暴露2 h后胎盘滋养细胞GRP78蛋白表达明显上调,而12 h和24 h后GRP78蛋白表达却显著下调;镉暴露6 h后胎盘滋养细胞p IRE1a蛋白表达明显上调,而24 h的p IRE1a蛋白水平却低于0 h;随着时间增加,胎盘滋养细胞pe IF2a、CHOP和p JNK蛋白表达均逐渐升高。上述结果提示,镉显著诱导胎盘滋养细胞内质网应激和未折叠蛋白反应。实验2结果表明,自由基清除剂PBN显著对抗镉上调胎盘组织内质网应激相关蛋白(GRP78、pe IF2a和CHOP)表达,缓解镉对小鼠胎盘还原型谷胱甘肽(GSH)的耗竭,且拮抗镉上调胎盘组织3-硝基酪氨酸(3-NT)和血红素氧化酶1(HO-1)蛋白表达。这些研究结果提示,活性氧至少部分介导镉诱导胎盘内质网应激。实验3结果发现,镉处理明显下调人胎盘滋养细胞营养物质转运泵(GLUT1、FATP4、PCFT)和生长因子(PGF和IGF2)m RNA表达,IRE-1 si RNA预处理明显对抗镉下调胎盘滋养细胞生长因子(PGF和IGF2)m RNA表达,而对镉下调胎盘滋养细胞营养物质转运泵(GLUT1、FATP4、PCFT)m RNA表达无影响。上述结果提示,内质网未折叠蛋白反应下游IRE-1信号部分介导镉损害胎盘滋养细胞内分泌功能。结论:镉暴露显著诱导胎盘滋养细胞内质网应激和未折叠蛋白反应,活性氧在镉诱导胎盘内质网应激中起关键作用,而未折叠蛋白反应下游IRE1通路在镉损害胎盘滋养细胞内分泌功能中起重要作用。综合以上三部分研究结果,本文得出如下结论:(1)孕期母体镉暴露显著升高胎儿生长受限的发生风险;(2)孕期母体镉暴露引起胎盘镉蓄积,导致胎盘结构与功能障碍,并诱发胎鼠生长受限;(3)镉显著诱导胎盘滋养细胞内质网应激和未折叠蛋白反应,活性氧在镉诱导胎盘内质网应激中起关键作用,而内质网IRE1信号在镉损害胎盘滋养细胞内分泌功能中起重要作用。