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目的:通过研究化痰散结方对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR耐药相关蛋白和凋亡抑制基因表达的影响,阐发其逆转多药耐药的作用机理,为中医治疗乳腺癌化疗中普遍存在的耐药相关问题提供理论和实验依据。方法:1.化痰散结方对MCF-7/ADR细胞多药耐药相关蛋白及基因的研究1)MTT法检测化痰散结方对MCF-7/ADR细胞系的耐药逆转作用,计算耐药逆转倍数;2)流式细胞术检测含药血清作用前后MCF-7/ADR细胞表面P-gp的表达变化;3)免疫印迹技术检测化痰散结方含药血清对MCF-7/ADR细胞中MRP蛋白(多药耐药相关蛋白)表达的影响;4)RT-PCR法检测含药血清作用前后MCF-7/ADR细胞中基因MDR1及MRP1的表达变化。2.化痰散结方对MCF-7/ADR细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用1)通过克隆形成实验,观察含药血清对细胞克隆形成的影响,计算克隆形成率;2)流式细胞技术检测化痰散结方对MCF-7/ADR细胞的细胞周期的影响;3)在荧光显微镜、电子显微镜下观察含药血清作用前后细胞的形态变化;4)流式细胞技术检测化痰散结方对MCF-7/ADR细胞凋亡抑制基因Bcl-2的影响。结果:1.化痰散结方逆转MCF-7/ADR细胞多药耐药及机制研究1)化痰散结方含药血清对MCF-7/ADR细胞的增殖有明显抑制作用,并随含药血清浓度提高、作用时间延长抑制作用增强。2)化痰散结方含药血清能显著抑制MCF-7/ADR细胞P-gp的表达,与对照组比较有统计学意义(P<0.01);10%含药血清与ADM合用组同VRP+ADM+10%正常鼠血清组比较差异无统计学意义(P>0.05)。3)ADM可诱导MRP表达上调,而含药血清可使MRP表达下降,其作用随浓度增加和作用时间的延长而增强。4)MDR1及MRP1mRNA在MCF-7/ADR细胞中高表达,化痰散结方含药血清作用于MCF-7/ADR后,MDR1及MRP1mRNA的表达下降,呈浓度依赖性。2.化痰散结方对MCF-7/ADR细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用1)随化痰散结方含药血清浓度递增,细胞克隆形成率逐渐下降。2)化痰散结方含药血清可使耐药细胞株阻滞于G0-G1期,并通过启动凋亡机制阻止耐药细胞株增殖,并呈量效关系(P<0.05)。3)化痰散结方对MCF-7/ADR细胞超微结构的影响表明随着药物浓度提高和作用时间延长,凋亡细胞的比例增高。4)化痰散结方含药血清组可显著下调细胞凋亡抑制基因Bcl-2的表达,并呈量效关系(P<0.05)。结论:1.化痰散结方作用于MCF-7/ADR细胞的耐药相关蛋白和基因,其机制可能与下调耐药细胞MDR1及MRP1的mRNA和蛋白表达,减少药物外排,增加耐药细胞内药物浓度有关。2.化痰散结方具有抑制肿瘤增殖和诱导凋亡的作用,其机制可能是作用于耐药细胞G1/S节点,使耐药细胞株阻滞于G0-G1期,下调细胞凋亡抑制基因Bcl-2的表达,通过启动凋亡机制阻止耐药细胞株增殖。